磺化Cy5-NHS 活化酯Sulfo-Cyanine 5 NHS ester

概述

磺化Cy5-NHS活化酯（Sulfo-Cy5 NHS Ester）是一种水溶性的远红色荧光染料，属于花菁染料（Cyanine）系列。其核心结构为磺化Cy5荧光团，并通过NHS酯基团活化，可与含氨基的生物分子（如蛋白质、抗体、多肽、核酸等）共价结合，实现荧光标记。磺化修饰显著提高了染料的水溶性，使其在标记反应中无需有机助溶剂，特别适用于水相缓冲液中的生物标记。该产品货号为PC21417，CAS号为2230212-27-6，呈深蓝色固体，易溶于水及甲醇、DMF等有机溶剂。

理化性质

• 外观：深蓝色固体
• 分子式：C₃₉H₄₃KN₃O₁₁S₂（基于典型结构）
• 分子量：约 856.0 g/mol
• 溶解性：极易溶于水，易溶于甲醇、DMF等有机溶剂
• 光谱性质：
• 激发波长（Ex）：约 646 nm
• 发射波长（Em）：约 662 nm（远红光区）
• 摩尔消光系数：约 250,000 M^-1cm^-1
• 荧光量子产率：约 0.2（水相）
• 反应基团：NHS酯，可与伯氨基（-NH₂）反应形成稳定的酰胺键
• 稳定性：对pH不敏感，避光、干燥条件下稳定

应用领域

• 蛋白质与抗体标记：用于免疫荧光（IF）、免疫组化（IHC）、Western Blot等，尤其适合水相标记体系。
• 多肽与核酸标记：用于多肽、寡核苷酸等生物分子的荧光示踪。
• 流式细胞术：远红光通道（如APC通道）兼容，适用于多色分析。
• 活细胞成像：水溶性好，降低非特异性结合，适用于长时间活细胞观察。
• 小动物活体成像：远红光穿透性强，背景低，适用于活体荧光成像。
• 荧光共振能量转移（FRET）：可作为受体或供体，与合适配对染料使用。

实验方案建议

1. 标记缓冲液准备

• 推荐使用无菌、无氨基的缓冲液，如PBS（pH 7.2-7.5）或碳酸氢钠缓冲液（0.1 M，pH 8.3-8.5）。
• 避免使用含伯氨基的缓冲液（如Tris、甘氨酸），以免竞争反应。

2. 染料储备液配制

• 将磺化Cy5-NHS活化酯溶于无水DMSO或DMF，配制成10 mM储备液（可根据溶解度调整）。
• 储备液应避光保存，建议现配现用，或分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。

3. 标记反应

• 蛋白质/抗体：按染料与蛋白质摩尔比（D/P）5-10:1进行标记。例如，对于1 mg/mL的抗体溶液，每毫升加入适量染料储备液，轻轻混匀。
• 反应条件：室温避光反应1-2小时，或4℃过夜。
• 反应体积：建议反应体系中最少含5%有机溶剂（来自染料储备液），以助溶解，但水溶性染料对有机溶剂耐受性较好。

4. 纯化

• 反应结束后，使用脱盐柱（如Sephadex G-25）或透析去除游离染料。
• 对于抗体，也可使用Protein A/G亲和纯化。

5. 标记度（DOL）测定

• 使用分光光度法测定：
• 染料浓度：A₆₄₆ / ε_染料（ε₆₄₆ ≈ 250,000 M^-1cm^-1）
• 蛋白质浓度：A₂₈₀需扣除染料贡献（校正因子CF₂₈₀ ≈ 0.05）
• DOL = 染料摩尔浓度 / 蛋白质摩尔浓度

6. 注意事项

• 全程避光操作。
• 反应体系避免含胺类物质。
• 染料水解：NHS酯在水溶液中易水解，建议现配现用，反应时间不宜过长。
• 标记后产物应避光保存于4℃（短期）或-20℃（长期），添加0.1% NaN₃防腐。

储存条件

• 储存温度：-20℃避光、干燥保存。
• 储存形式：固体粉末或无水DMSO/DMF储备液（分装）。
• 保质期：在推荐条件下通常为12个月。
• 注意事项：避免反复冻融储备液；避免接触水分和潮湿环境；取用时需平衡至室温后再开盖，防止冷凝水。

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