概述
Cy5-NHS 活化酯(Cyanine 5 N-Hydroxysuccinimide Ester,货号 PC21411,CAS 号 1032678-42-4)是一种基于花菁染料的近红外荧光标记试剂。其分子结构由 Cy5 染料母核与 N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS ester)活性基团连接而成,兼具高效的共价偶联能力和优良的光学特性。该试剂可与含伯氨基(-NH2)的分子(如蛋白质、抗体、多肽、核酸等)发生反应,形成稳定的酰胺键,实现荧光标记。Cy5-NHS 的最大激发波长约为 649 nm,最大发射波长在 670 nm 左右,处于近红外“组织光学窗口”内,能有效减少生物组织对光的吸收和散射,从而提升深层组织成像的穿透深度和信噪比;其光稳定性优异,抗光漂白能力强,适用于长时间动态观测;可与绿色或橙红色荧光染料(如 AF488、TAMRA)兼容,支持多色荧光联用。
理化性质
外观: 深蓝色固体
溶解性: 易溶于 DMF、DMSO 等有机溶剂,在水相中需现配现用(建议先用无水有机溶剂溶解后加入缓冲液)。
光谱特性: 最大激发波长(λex)≈ 649 nm,最大发射波长(λem)≈ 670 nm(近红外区)。
活性基团: NHS 酯,可与伯氨基(-NH2)在温和条件下(pH 7.2-8.5)反应形成共价酰胺键。
稳定性: 对光和湿气敏感,需避光、干燥、低温保存。
分子量: 约 634.2 g/mol(以常见 Cy5-NHS 结构计,具体以实际批次为准)。
应用领域
- 生物分子标记: 用于标记蛋白质、抗体、多肽、核酸等含氨基的生物分子,适用于荧光免疫分析、Western Blot、细胞成像等。
- 体内/体外成像: 近红外荧光特性使其适用于小动物活体成像、深层组织成像及血管成像。
- 流式细胞术: 可标记抗体用于多色流式分析。
- 荧光探针构建: 作为近红外荧光模块,用于构建靶向探针、传感器等。
- 多色荧光联用: 与 AF488、TAMRA 等染料搭配,实现多通道检测。
实验方案建议
1. 试剂准备
- 将 Cy5-NHS 活化酯从 -20℃ 取出,平衡至室温后再打开,避免吸潮。
- 用无水 DMF 或 DMSO 溶解,配制成 10 mM 储备液(建议现配现用,或分装后 -20℃ 避光保存,避免反复冻融)。
2. 标记反应(以抗体为例)
- 将抗体溶于 PBS(pH 7.4)或碳酸盐缓冲液(pH 8.0-8.5)中,浓度建议 1-2 mg/mL。
- 按 Cy5-NHS 与抗体摩尔比 5-10:1 加入储备液,轻轻混匀。
- 室温避光反应 1-2 小时(或 4℃ 过夜)。
3. 纯化
- 使用凝胶过滤柱(如 Sephadex G-25)或透析去除游离染料,收集标记产物。
- 测定标记效率:计算染料/蛋白摩尔比(DOL),通常建议 DOL 在 3-7 之间。
4. 验证
- 通过 SDS-PAGE 荧光成像或紫外-可见分光光度法(A649 和 A280)确认标记效果。
注意事项: 反应缓冲液中避免含有伯氨基(如 Tris、甘氨酸),以免竞争反应;操作全程避光。
储存条件
- 储存温度: -20℃ 避光、干燥保存。
- 储存形式: 固体粉末或有机溶剂储备液(分装后 -20℃ 避光保存)。
- 注意事项: 避免反复冻融和暴露于潮湿环境;储备液建议用无水 DMF 或 DMSO 配制,并充惰性气体保存。
- 保质期: 在推荐条件下保存,自收到之日起 12 个月内使用。
相关产品推荐
- Cy3-NHS 活化酯(货号:PC21311):橙红色荧光标记,激发/发射 ~550/570 nm。
- Cy5.5-NHS 活化酯(货号:PC21511):近红外荧光标记,激发/发射 ~675/695 nm。
- Cy7-NHS 活化酯(货号:PC21611):近红外荧光标记,激发/发射 ~750/770 nm。
- AF488-NHS 活化酯(货号:PC20111):绿色荧光标记,激发/发射 ~495/519 nm。
- TAMRA-NHS 活化酯(货号:PC20211):橙红色荧光标记,激发/发射 ~555/580 nm。
- Sephadex G-25 凝胶过滤柱(货号:PC30101):用于标记后纯化。