磺酸基-Cy5-乙基 琥珀酰亚胺酯（远红外）Sulfo-Cy5-E SE (FIR)

概述

磺酸基-Cy5-乙基 琥珀酰亚胺酯（Sulfo-Cy5-E NHS Ester，货号PR01393，CAS号146368-14-1）是一种基于Cy5远红外荧光染料骨架改性的生物标记试剂。其分子结构在共轭的吲哚环上引入了强吸电子的磺酸基（Sulfo-），显著提升了水溶性，克服了传统Cy5在水相中的疏水性聚集问题。分子末端连接了N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS Ester）基团，使该化合物能够高效地与蛋白质、抗体或核酸分子中的伯胺基（-NH₂）发生酰胺键共价偶联。磺酸基的引入增强了分子在生理条件下的稳定性，Cy5染料在近红外区域的强荧光特性（激发/发射波长约为648/671 nm），位于生物组织的近红外窗口（NIR），自发荧光干扰极低，光子穿透深度大，能够提供极高的信噪比和成像质量。

理化性质

应用领域

• 蛋白质/抗体标记：用于免疫荧光（IF）、免疫组化（IHC）、流式细胞术（FACS）、Western blot 等，通过伯胺偶联实现荧光标记。
• 核酸标记：标记氨基修饰的寡核苷酸，用于荧光原位杂交（FISH）、qPCR 探针等。
• 活体成像：近红外荧光成像，适用于小动物活体成像，具有深组织穿透性和低背景。
• 细胞成像：标记细胞表面蛋白或胞内蛋白，用于共聚焦显微镜、高内涵成像。
• 多色荧光分析：与其它荧光染料（如 FITC、Cy3、Cy7）配合使用，进行多重检测。
• 药物递送研究：标记纳米颗粒、脂质体等，追踪其体内分布。

实验方案建议

1. 标记反应的一般流程（以抗体标记为例）

• 缓冲液准备：使用不含伯胺的缓冲液（如 PBS、碳酸氢钠缓冲液，pH 7.4-8.5）。避免使用 Tris、甘氨酸等含胺缓冲液。
• 抗体准备：将抗体溶解于上述缓冲液中，浓度建议 1-5 mg/mL。若含有叠氮钠或 BSA，需先透析或脱盐去除。
• 染料溶解：将 Sulfo-Cy5-E NHS Ester 用无水 DMSO 溶解成 10 mM 储备液（现配现用）。
• 标记反应：按染料:抗体摩尔比 3:1 至 10:1 加入染料储备液，轻柔混匀，室温避光反应 1-2 小时。
• 纯化：使用脱盐柱（如 Sephadex G-25）或超滤离心管（MWCO 30 kDa）去除游离染料。
• 验证：测定标记后抗体的 DOL（Degree of Labeling）和荧光光谱。

2. 关键注意事项

• pH 控制：反应 pH 应在 7.4-8.5 之间，确保伯胺去质子化。
• 避光操作：全程避免强光照射，防止荧光淬灭。
• 染料当量优化：过度标记可能导致抗体活性下降或荧光自淬灭，建议进行预实验优化比例。
• 缓冲液纯度：使用高纯度水配制缓冲液，避免杂质干扰。

3. 标记效率检测

• DOL 计算：使用紫外-可见分光光度计测量 280 nm 和 650 nm 吸光度，按公式计算。
• 荧光光谱：确认激发/发射峰位置未发生明显偏移。

4. 常见问题与解决方案

• 标记效率低：检查 pH 是否正确、染料是否失效、抗体浓度是否过低。
• 聚集现象：磺酸基修饰已提高水溶性，若仍出现聚集，可适当增加 DMSO 比例或超声处理。
• 荧光淬灭：避免使用含卤素离子的缓冲液，储存时加入少量抗氧化剂（如 0.1% 叠氮钠）。

储存条件

• 储存温度：-20°C 避光干燥保存，有效期 12 个月。
• 储存形式：固体粉末或无水 DMSO 储备液（分装后 -80°C 保存，避免反复冻融）。
• 注意事项：避免暴露于强光、潮湿和高温环境；使用前平衡至室温再开盖，防止吸潮。
• 运输条件：室温运输，避光防潮。

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