Cy3-NHS 活化酯Cyanine3 NHS Ester

概述

Cy3-NHS 活化酯（Cy3 NHS Ester，CAS 1032678-38-8）是一种明亮的橘红色荧光染料，属于花菁染料（Cyanine）系列。其分子式为 C₃₄H₄₀ClN₃O₄，分子量 590.15，含氯离子（Cl^-）。该试剂具有 NHS 酯活性基团，可高效、特异性地与生物分子中的伯胺（-NH₂）共价结合，实现荧光标记。Cy3-NHS 活化酯广泛应用于流式细胞术、荧光显微镜、原位杂交（FISH）、蛋白质相互作用研究等生物学实验，是生命科学研究中常用的荧光标记工具。

理化性质

• 外观：红色固体
• 分子式：C₃₄H₄₀ClN₃O₄
• 分子量：590.15
• 溶解性：易溶于甲醇、DMF 等有机溶剂，微溶于水
• 荧光特性：激发波长（Ex）约 550 nm，发射波长（Em）约 570 nm，呈明亮的橘红色荧光
• 光稳定性：强
• pH 稳定性：pH 4-10 范围内稳定
• 反应基团：NHS 酯，可与伯胺（-NH₂）反应形成稳定的酰胺键

应用领域

• 蛋白质与肽段标记：用于抗体、酶、多肽等含氨基生物分子的荧光标记，适用于免疫荧光、Western blot 等。
• 核酸标记：可标记氨基修饰的寡核苷酸（DNA/RNA），用于荧光原位杂交（FISH）、实时定量 PCR 探针等。
• 流式细胞术：标记细胞表面抗原或胞内蛋白，用于多色流式分析。
• 荧光显微镜：用于细胞或组织切片的免疫荧光染色、亚细胞结构定位等。
• 蛋白质相互作用研究：通过荧光共振能量转移（FRET）等技术研究蛋白-蛋白、蛋白-核酸相互作用。
• 其他：如荧光免疫分析、生物传感器构建等。

实验方案建议

1. 试剂准备

• Cy3-NHS 活化酯通常以无水 DMF 或 DMSO 溶解，配制成 1-10 mM 的储备液，现配现用，避免反复冻融。
• 待标记生物分子（如蛋白质）应溶解于不含氨基的缓冲液中（如 PBS、碳酸氢钠缓冲液，pH 7.5-8.5），避免使用 Tris、甘氨酸等含氨基缓冲液。

2. 标记反应

• 按适当摩尔比（染料:蛋白质 = 3:1 至 10:1）将 Cy3-NHS 储备液缓慢加入生物分子溶液中，轻轻混匀。
• 避光条件下，室温反应 1-2 小时或 4℃ 过夜。

3. 纯化

• 反应结束后，可通过凝胶过滤（如 Sephadex G-25）、透析或超滤等方法去除游离染料。
• 纯化后的标记物应避免光照，可加入少量叠氮钠（0.02%）防腐，4℃ 保存短期使用。

4. 标记效率检测

• 使用紫外-可见分光光度计测定标记物的吸光度，根据 Cy3 的摩尔消光系数（ε₅₅₀ ≈ 150,000 M^-1cm^-1）和蛋白质的吸光度计算标记比（DOL）。
• 也可通过荧光光谱或 SDS-PAGE 荧光成像验证标记效果。

注意事项

• 反应体系需避光，防止荧光淬灭。
• 染料储备液应避免水分，防止 NHS 酯水解失效。
• 标记反应需优化染料与生物分子的比例，避免过度标记导致生物分子活性下降或聚集。

储存条件

• 储存条件：避光、干燥、-20℃ 保存。
• 注意事项：
• 产品应密封保存，避免吸潮，防止 NHS 酯水解。
• 储备液建议分装后于 -20℃ 避光保存，避免反复冻融。
• 使用前平衡至室温再开盖，避免冷凝水进入。
• 有效期请参见产品标签。

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