细胞膜远红荧光染色试剂盒(DiD),Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiD (Far-red Fluorescence)是一种以DiD为荧光探针,并提供了染色增强剂、能快速灵敏地对细胞膜进行远红荧光染色标记的试剂盒。
DiD即DiIC18(5),也称为DiD' solid,全称为1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine,4-Chlorobenzenesulfonate Salt,分子式为C67H103ClN2O3S,分子量为1052.08。DiD是DiI的类似物,但具有更长的激发和发射波长,为远红荧光,在一些细胞和组织染色中更有优势,特别适合用于进行多种荧光的同时染色。DiD是一种亲脂性羰花青(carbocyanine)染料,具有很长的亲脂性烃链,进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色,染色后非常稳定。
DiD可被633nm的氦-氖(He-Ne)激光所激发,DiD在进入细胞膜之前荧光非常弱,仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiD被激发后可以发出远红的荧光,DiD和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参考说明书。其中,最大激发波长为644nm,最大发射波长为665nm。
DiD被广泛用于正向或逆向的、活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(long-term tracer)。DiD毒性很低,通常不会影响细胞的生存力(viability)。
本试剂盒提供了染色增强剂,使细胞膜染色更加快速,荧光染色更加明亮,染色背景更低。
本试剂盒除了最简单的细胞膜荧光标记外,还可以用于检测细胞的融合和粘附,检测发育或移植过程中细胞迁移,通过FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)检测脂在细胞膜上的扩散,检测细胞毒性和标记脂蛋白等。
本试剂盒可以直接染色活的细胞或组织,染色时间通常为5-20分钟。对于固定的细胞或组织,通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛进行固定,使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。
DiD染色后可以兼容免疫荧光实验。建议使用碧云天的免疫染色通透液(Saponin)或使用洋地黄皂苷配制的不会溶解细胞膜的通透液进行通透,其它去垢剂配制的通透液可能会溶解细胞膜上的脂类物质,造成DiD失去结合位置,最终导致DiD的染色失效。但通透也可能会影响DiD在细胞膜上的定位并会增加细胞内的染色,具体实验中需根据实验的需求选择合适的细胞通透液。
如果用于流式细胞仪,每个样品的检测体系体积为0.5ml时,可以进行200次检测;96孔板每孔检测体系的体积为100μl时可以进行1000次检测。