核酸凝胶电泳是分子生物学实验室中分离、鉴定和纯化核酸（DNA/RNA）的核心技术之一，其原理基于核酸分子在电场中因分子量、构象差异产生的迁移速率不同，最终实现分离。该技术广泛应用于PCR产物验证、质粒酶切鉴定、核酸纯度分析等场景。核酸染料在凝胶电泳技术中起着至关重要的作用，它们能够特异性地与DNA或RNA分子结合，使得在电泳过程中迁移的核酸条带在适宜的激发光源下清晰可见。

核酸

       核酸（Nucleic Acid）是生物体中携带遗传信息的大分子，由多个核苷酸单体（五碳糖、磷酸基团及含氮碱基）堆积组成。核酸的两个主要类别为脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA）及核糖核酸（Ribonucleic Acid, RNA）。其中，DNA主要存在于细胞核中（少量存在于线粒体或叶绿体），是所有非寄生生物和大多数病毒的遗传物质。与RNA一起，通过指导蛋白质的合成过程，决定了地球上每个个体的遗传特征。

       Watson和Crick于1953年提出了B-DNA的双螺旋结构模型：即DNA是由两条相互平行、方向相反的寡聚核苷酸所构成，它们按照碱基互补配对原则（A-T、C-G）缠绕形成右手双螺旋。

图1 DNA化学组成及结构

       DNA分子是一种自身不会发出荧光的大分子，需要相应的核酸分子染料与DNA结合，通过特定波长的光源（称之为“激发光源”）去激发DNA与核酸染料的复合物，复合物就会发出另一个波段的荧光（称之为“发射光”）。核酸染料与琼脂糖凝胶中DNA片段结合后，在特定光谱照射下发出荧光条带，从而指示DNA片段大小和质量。

       核酸在生物学、医学、法医等领域都有广泛应用，尤其是核酸检测（PCR、实时荧光PCR、等温扩增等）已成为传染病快速诊断、基因检测、药物研发的重要技术手段。因此，DNA含量、功能及结构变化等动态信息的获取，对上述研究领域均至关重要，核酸染料也随之产生。

核酸染料

       核酸染料是一种能够与核酸结合的化合物，一般是芳香环化合物，分子中含有苯环或吡啶环，这些环结构可以吸收紫外线或蓝光，并发出荧光。核酸染料是生物相关实验室常规使用的基础试剂，他们可通过非共价作用识别核酸分子及其不同的二级结构，根据染料与核酸结合前后其自身发光性质的变化能够实现对不同场景下，核酸分子的定性或定量分析。

       核酸染料的起源最早可追溯到一些抗疟药物，如吖啶及菲啶化合物。在荧光显微镜问世的20多年后，吖啶染料才开始被应用于生物体染色，并表现出对细菌良好的染色性能。1949年，Parker在溶液中证实了吖啶类及喹啉类染料的染料能够与核酸相互作用，该结果初步解释了吖啶类染料抗菌及选择性生物染色的原因。

图2 核酸染料的DNA定量方法发展时序图

       核酸染料在核酸结构的研究中起着重要的作用，两者的结合方式由染料分子结构、核酸构象（如双链、单链）共同决定，不同结合方式直接影响染色特异性、荧光响应机制及适用场景，其可通过插层作用、静电吸附作用或嵌入沟槽等方式与DNA/RNA相结合。

1、插层作用（Intercalation）

       这是最经典的结合方式，主要针对双链核酸（dsDNA、dsRNA），双链核酸的碱基对堆叠形成可容纳染料分子的“间隙”。

       染料分子多含平面芳香环结构（如苯环、吖啶环），能像“楔子”一样插入双链核酸的碱基对之间，破坏原有碱基对的疏水堆叠作用；同时，染料的亲水基团（氨基、羟基）与核酸磷酸骨架的氧原子形成氢键，进一步稳定结合。

       仅结合双链核酸（单链核酸无稳定碱基对结构，无法提供嵌入空间），部分可同时结合dsDNA和dsRNA（如溴化乙锭 EB）。对AT、GC碱基对无明显偏好（或偏好极弱），能均匀结合双链核酸。未结合时染料荧光极弱（因分子自由旋转导致荧光猝灭），结合后构象受限，荧光强度提升数十至千倍（如SYBR Green I结合dsDNA后荧光增强约1000倍）。

2、静电吸附作用（Electrostatic Binding）

       主要依赖正负电荷相互作用，对核酸类型（双链/单链、DNA/RNA）选择性低，常作为辅助结合方式，或在特定条件下成为主要方式。

       核酸的磷酸骨架带负电荷，而多数核酸染料分子带正电荷（如吖啶橙、EB），二者通过静电吸引结合；部分染料（如AO）在高浓度时，除嵌入双链核酸外，还会通过静电作用结合于核酸磷酸骨架外侧，或结合单链核酸（ssDNA、ssRNA）的磷酸基团（单链核酸无稳定碱基对，仅能通过静电结合）。

       可结合dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA，甚至与带负电的蛋白质、多糖非特异性结合，背景干扰较高。单独静电结合时，染料荧光增强效果远低于插层结合，需与其他结合方式协同（如AO低浓度插入dsDNA发绿色荧光，高浓度静电结合ssRNA发红色荧光，可区分双链与单链核酸）。

3、嵌入沟槽（Groove Binding）

       针对双链核酸的大沟或小沟（双链核酸双螺旋表面因碱基排列形成的凹陷结构），无需破坏碱基对，是对核酸结构干扰最小的结合方式。

       染料分子多为非平面、带正电的小分子（如吲哚类、苯并咪唑类），通过三重作用结合：①疏水相互作用（染料疏水基团与沟槽内碱基边缘的疏水区域结合）；②氢键作用（染料的氨基、羰基与碱基特定原子形成特异性氢键，如Hoechst与A-T碱基对的N6、O4结合）；③静电作用（染料正电荷与核酸磷酸骨架负电荷吸引，辅助定位）。

       多数偏好A-T富含区（因A-T沟槽更宽、疏水作用更强，如Hoechst 33258、DAPI），少数偏好G-C富含区。仅结合双链核酸（单链无沟槽结构），部分对dsDNA的选择性高于dsRNA（如DAPI几乎不结合dsRNA）。

常用的核酸染料

1、溴化乙锭

       溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB) 是最早使用也是最常使用的染料，其含有一个扁平吖啶环可插入DNA或RNA双链中相邻的碱基对之间（即“碱基堆积”区域），同时其分子末端的氨基与核酸骨架的磷酸基团形成弱静电作用，进一步稳定结合。它与DNA的结合没有碱基序列特异性，直接嵌入DNA碱基对之间，形成稳定的EB-DNA复合物，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子，这种结构对DNA的空间结构影响不大｡

       因其便宜、灵敏度高且操作方便等特点，一直作为琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。溴化乙锭在紫外区302nm处有吸收峰，在紫外光的照射下，溴化乙锭可被激发出橙红色的荧光（590nm）。结合有DNA的溴化乙锭复合物的荧光强度要比没有结合DNA的染料高出20-30倍，因此溴化乙锭可检测到少至10ng的DNA条带，非常灵敏。适用于各种类型的核酸凝胶，包括琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。

图3 EB染料的光谱图

       需要注意的是，溴化乙锭经艾姆斯实验（Ames）证实有强致癌性和诱变性，对人体潜在危害非常大。溴化乙锭虽在核酸电泳技术发展中起到重要作用，但其强毒性和致癌性决定了使用时必须以 “安全优先”，严格遵守操作规范；在有条件的情况下，推荐优先使用更安全的替代染料，平衡实验需求与人员健康、环境安全。

2、GelGreen和GelRed

       GelGreen和GelRed是一种灵敏、稳定和相对安全的荧光核酸染色试剂。既可用于预制凝胶也可用于电泳后染色。通常电泳后染色的灵敏度更高，并能排除染料对DNA迁移的干扰。在采用GelGreen与GelRed开展电泳后染色时，仅需将染料用0.1M NaCl溶液稀释，随后将电泳后的凝胶放入配制好的染色液中浸泡即可；待浸泡30分钟后，便能直接对凝胶上的核酸条带进行观察。相比而言，预制凝胶由于不需要额外染色过程，因此染料用量更少，更为简单经济。

       与EB相比，GelRed展现出更高的检测灵敏度，特别是在染色小分子量核酸时，效果尤为出色。GelRed是一种二聚体插层染料，具有独特的油性和大分子特点，在检测低浓度或微量的DNA和RNA方面，也显示出比EB更优越的性能。GelRed的稳定性和染色重复性都非常出色，可以在室温下长时间保存，并且能够耐受微波炉加热，这为实验操作提供了极大的便利。在光谱特性上，GelRed与EB的激发光和发射光非常相似，因此可以直接用GelRed替代EB，无需更换现有的仪器设备。同时，GelRed的使用方式也与EB保持一致。

       Gelgreen在蓝光区域激发，无需紫外光照射，减少了对操作人员的健康风险。相较于EB，GelRed和GelGreen的价格相对较高，增加了实验成本。

图4 GelRed染料光谱图

3、Goldview

       Goldview是一种吖啶橙类核酸染料，也是一种可替代溴化乙锭的新型核酸染料，采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA时，其与DNA发生结合并产生很强的荧光信号，灵敏度与EB相当。在紫外透射光下，双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈现红色荧光。Goldview虽然毒性较低，但仍具有一定的细胞毒性。因此，在使用时也需要做好防护措施。

       在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。对于大片段DNA的染色效果良好，但是在对于500bp以下的片段效果不是很好，致命的弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min条带就会消失。

4、SYBR

       核酸染料SYBR系列：SYBR Green I/II（SG），PicoGreen（PG），SYBRGold（Gold）及SYBR Safe。此系列染料均具有十分优异的性质，其中SG游离状态时几乎无荧光，与DNA作用后荧光强度可提升近千倍，因此能够实现高灵敏的DNA定量分析。

图5 核酸染料SYBR系列

       SYBR Green I(SG)是一种非对称花菁染料，包含N-烷基化苯并噻唑鎓或苯并恶唑鎓环系，其通过单次甲基桥连接到带有杂原子取代基的吡啶鎓或喹啉鎓环系，能够结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域。在游离状态下，SYBR Green I只能发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。因此常用于QPCR定量检测当中。

       SYBR Green II主要用于对RNA或单链DNA进行染色，SYBR Green II对单链核酸的结合效率是双链的约2倍，能够检测出极低浓度的核酸，灵敏度高于传统染料如EB。且无需脱色或冲洗步骤，简化了实验流程。

       SYBR Gold在灵敏度上有明显的优势，是这一系列染料中灵敏度最高的。它一旦结合核酸，荧光会增强1000倍以上。SYBR Gold染料可用于检测包括双链DNA，单链DNA和RNA，适用于琼脂糖凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性(SSCP)研究，以及其他常规的分析。与溴化乙锭相比，SYBR Gold的诱变性更低，对人体和环境更安全。

       SYBR Safe使用溴乙非啶溴化物导致突变的几率更低，更为安全。它避免了过度光暴露的问题，可在室温下储存，为实验提供了便利。低毒性、对人和环境无害。SYBR Safe染料具有卓越的核酸可视化灵敏度，无论是紫外光激发还是蓝光激发，都有文献应用证明其灵敏度。它能够与DNA结合并发出绿色荧光，激发荧光波长最大为280和502 nm，发射荧光波长最大为530 nm。因此，核酸被染色后，可通过标准的紫外透射仪、可见光透射仪或激光扫描仪来查看。大家都知道，紫外光对DNA是有损伤的，如果用SYBR Safe搭配蓝光透射仪，就不会有这种问题，也无需担心紫外线对眼睛的损伤。

       PicoGreen是一种花青染料，带有两个N,N‑二甲基氨基基团，形成正电荷，提升对负电荷DNA背骨的静电吸引，仅在与dsDNA结合后才会发出荧光，它通过与dsDNA小沟区域特异性结合，使染料分子的荧光量子产率大幅提高，产生的荧光强度与dsDNA浓度成正比，从而实现对dsDNA的定量检测。其激发波长为480nm左右，发射波长为520nm左右，与大多数荧光计和荧光酶标仪兼容。由于PicoGreen灵敏度高、特异性强、耐受性好、无需纯化DNA，从2010版中国药典开始，已被列为生物制品DNA残留检测的标准方法之一。根据药典说明，当dsDNA浓度在1.25 ng/mL~80 ng/mL范围内时线性最好 (R2 >0.99)。

5、Super Safe Red

       Super Safe Red是一种高灵敏、无致突变性，安全和稳定的荧光核酸凝胶染色试剂（在工作浓度中）。它可替代EB，且具有远高于EB的灵敏度，同时不需要脱色。Super Safe Red和EB有相同的光谱特性，主要适用于紫外亦兼容于蓝光凝胶成像系统，无需更换现有的仪器设备。稳定性极好，可以使用微波炉加热，可以在室温下保存。Super Safe Red是一种高亲和力的大分子染料，能够与dsDNA、ssDNA和RNA结合，但对dsDNA的敏感性更好，从而实现对dsDNA的定量检测。通过环境动物测试实验和Ames突变性双重验证，证明Super Safe Red无致突变性且对环境无害。

图6 Super Safe Red染料光谱图

核酸染料评价体系

       1、安全性：安全性是核酸染料选择的核心前提，需通过多维度检测验证其对人体健康及生态环境的影响，具体评估方向包括：​

       毒性风险检测：依托权威实验方法判定染料的潜在危害，核心检测项目包括：​Ames试验（致突变性评估）：通过鼠沙门氏菌回复突变实验，检测染料是否诱导DNA突变，是判断致癌风险的关键指标；​

       细胞渗透性实验：模拟染料通过皮肤、黏膜进入人体的过程，评估其经接触吸收的风险；​

       染色体畸变与正向突变分析：直接观察染料对细胞染色体结构、DNA序列的影响，验证遗传毒性；​

       环境友好性：随着绿色实验理念的普及，染料的废弃后影响逐渐成为评价重点。需优先选择易生物降解、在水体/土壤中无长期残留毒性的染料，避免废弃染色液、污染凝胶对生态环境造成持续性污染，降低实验室废弃物处理的环保压力。​

       2、检测性能：检测性能直接影响实验数据的可靠性

       检测灵敏度：指染料可清晰识别的核酸最低浓度，是衡量其“检测下限”的关键。高灵敏度染料能在核酸浓度极低的场景下，仍呈现清晰可辨的条带或荧光信号，有效避免因样品量少、浓度低导致的漏检，提升实验结果的准确性，尤其适用于低丰度PCR产物、微量小RNA等样品的检测。​

       化学稳定性：优质染料需在存储（如- 20℃冷冻、4℃冷藏或室温短期放置）与使用过程中（如与电泳缓冲液混合、加热制备预制胶）保持分子结构稳定，不发生分解、变质或活性降低，确保不同批次、不同时间的实验结果具有一致性，减少因染料失效导致的实验误差。​

       光稳定性：染料可在成像过程中保持荧光信号稳定，避免因光照导致的信号衰减，尤其适合需要长时间曝光、多次成像的实验场景。​

       3、操作适配性：决定染料能否与常规实验流程兼容，减少操作复杂度与结果偏差，主要包括：​

       染色方式灵活性：根据染色与电泳的顺序，分为前染色与后染色两种模式，需结合实验需求选择适配类型：​

       前染色（凝胶制备时添加染料）：优势在于电泳过程中可随时观察条带迁移情况、无需额外染色步骤、染料用量少；但局限性在于，对分子量较大（如>10kb）或浓度较高的核酸染色时，易因染料与核酸的相互作用导致条带拖尾、弯曲或迁移变形，影响分子量判定。​

       后染色（电泳结束后浸泡凝胶染色）：虽需额外增加染色步骤（通常30-45分钟），但可有效避免前染色对大分子量、高浓度核酸的影响，条带形态更规整，是此类样品染色的优选方式。​

       对核酸迁移率与带型的影响：染料分子的大小、电荷性质、与核酸的结合方式（如嵌入强度、结合位点），可能改变核酸在凝胶中的迁移速率或条带形态。一般而言，染料分子越大、与核酸的结合作用越强（如强嵌入性染料），对迁移率的干扰越明显，甚至可能导致条带偏移、弥散。因此，选择时需优先考虑对核酸迁移行为影响小的染料，尤其在需精准判定核酸分子量（如与Marker对比）的实验中，该指标尤为关键。​

       4、经济性：在保障安全性、检测性能与操作适配性的前提下，染料的价格是评估性价比的重要因素。需结合实验室的常规用量和染料的有效浓度综合测算，在不牺牲实验质量的前提下，有效降低长期实验的耗材支出，尤其适合高频次使用、预算有限的教学实验室或大规模科研平台。