蛋白免疫印迹技术的雏形可以追溯到1970年代，当时W. M. Kelley与M. J. Bennett首次将电泳分离的蛋白与抗体特异性结合的概念联系起来，用于检测血清中的病毒抗原。

       1979年，斯坦福大学的Harry Towbin及其同事首次系统性地描述了将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜的方法，这一技术革新源于对DNA印迹（Southern Blotting）和RNA印迹（Northern Blotting）方法的成功借鉴与适应性改造。初期的蛋白转移采用毛细作用，随后电转移法因其高效性和重现性成为主流。

       1981年，Burnette正式将这一方法命名为"Western Blotting"，既遵循了核酸印迹技术的命名传统，又凸显了其蛋白质分析的本质特征。自此，Western Blot迅速成为分子生物学、细胞生物学以及临床诊断实验室的标准手段，并在随后四十余年中不断演进：从化学发光（ECL）‍到荧光二抗、从手工转膜到半自动转膜装置，从单克隆抗体到多重检测（Stripping + 再探针），形成了完整的技术体系。

基本原理

       蛋白免疫印迹（Western Blot）是一种基于电泳分离、膜转移与抗体特异性识别的蛋白定性与半定量分析方法。其核心在于：

       ①通过SDS‑PAGE将细胞裂解液或组织提取物中的蛋白按分子量分离；

       ②将分离后的蛋白电转移至亲和性强、化学惰性的固相支持膜（硝酸纤维素或PVDF）；

       ③用特异性一抗与目标蛋白结合，再用酶标记二抗（常为HRP‑标记）放大信号；

       ④通过化学发光（ECL）‍、荧光或酶底物显色等方式读取信号。

Western Blot实验流程

       这一技术的独特优势在于能够同时提供目标蛋白的分子量信息、相对表达量分析和翻译后修饰状态检测（如磷酸化、糖基化）。在基础研究领域，蛋白免疫印迹广泛应用于基因表达调控研究、信号转导通路解析、蛋白质相互作用验证以及疾病分子机制探索。在应用科学层面，该技术已成为药物开发中靶点验证的关键工具、临床前研究药效评价的标准方法以及生物制品质量控制的重要环节。

       特别值得指出的是，在病毒感染诊断（如HIV和HCV确认试验）、自身免疫疾病抗体筛查（如系统性红斑狼疮的抗核抗体检测）以及神经退行性疾病生物标志物发现中，蛋白免疫印迹因其高特异性和可靠性而成为金标准方法之一。随着定量蛋白质组学的发展，数字免疫印迹系统和多重荧光检测技术的融合，正在推动这一传统技术向更高通量、更精确定量的方向发展。

分子机制

       蛋白免疫印迹的技术原理建立在四个相互关联的物理化学与分子识别过程之上。

       首先是基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的蛋白质解聚与分离机制：SDS作为阴离子去垢剂，通过与蛋白质疏水区域结合破坏其高级结构，形成带负电的SDS-蛋白质复合物，其迁移速率主要取决于分子量大小，而几乎不受原始电荷和形状影响，这一特性使得分子量标记可作为精确的参照系统。

       其次是电转印过程的物理化学基础：在电场驱动下，凝胶中的蛋白质从阴极向阳极迁移，通过优化转印缓冲液的pH值（通常采用Tris-甘氨酸系统）和甲醇浓度（增强蛋白质与膜的结合能力），使蛋白质高效、均匀地吸附在硝酸纤维素膜或PVDF膜表面，这种吸附主要通过疏水相互作用和静电作用实现。

       第三是免疫识别的分子特异性：一抗与目标蛋白表位的结合遵循锁钥原理，这种结合具有高度选择性，识别表位通常为线性表位（对应变性蛋白质）或构象表位（需采用非变性电泳系统）。

       最后是信号放大与检测的生化反应：酶标二抗（常用辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP标记）通过识别一抗的物种特异性Fc段实现级联放大，化学发光底物（如ECL）在酶催化下产生光子信号，该过程涉及鲁米诺的氧化反应和增强剂（如对碘苯酚）的协同作用，可将检测灵敏度提升至传统显色法的10-100倍。

WB实验细节

BCA蛋白浓度测定

       BCA（二喹啉甲酸）蛋白浓度测定法是免疫印迹实验样品制备阶段的关键定量步骤，其原理基于碱性条件下蛋白质将Cu²⁺还原为Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂形成紫色的络合物，该复合物在562 nm处具有最大吸光度，其强度与蛋白质浓度成正比。与传统的Lowry法相比，BCA法的独特优势在于其对去垢剂（如SDS、Triton X-100）具有更好的耐受性，且操作更为简便快速。快速蛋白质定量试剂盒（BCA法）的原理与传统BCA蛋白定量法类似，但采用了一种不同于BCA的全新特殊的螯合剂，从而实现了对蛋白质浓度进行快速、稳定、灵敏的测定。

       实验过程中需建立标准曲线（通常使用牛血清白蛋白BSA），样品需适当稀释至线性范围内（20-2000 μg/mL）。该方法的灵敏度可达5 μg/mL，且不同蛋白质之间的变异系数较小，但需注意某些还原剂（如DTT、β-巯基乙醇）和高浓度螯合剂可能干扰测定结果。微量BCA试剂盒的发展，使得仅需1-2 μL样品即可完成准确测定，特别适用于珍贵样本的分析。

SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

       一步法彩色快速凝胶配制试剂，采用上层胶(也称浓缩胶、积层胶)和下层胶(也称分离胶)的预混配方，只需加入改良型促凝剂即可快速制备凝胶，避免的传统制胶法中TEMED的恶臭味，保护了实验人员的身体健康，可在短时间内制备多块凝胶，无需计算所需溶液量，无需稀释，操作简便，无需压胶操作。

       使用该试剂所配置的上层胶带有颜色(绿色、紫色、红色、蓝色)，使得蛋白点样孔清晰呈现，实现了加样过程的可视化，极大的提高了加样效率，有利于点样和控制电泳进程。上层胶中的带色染料可在上层胶中稳定存在，不会随着电泳而迁移至下层胶，不会影响电泳和蛋白染色效果，电泳完成后也便于识别上层胶并切除。

考马斯亮蓝染色液检测

       考马斯亮蓝G-250染色是评估SDS-PAGE分离效果和转膜效率的重要质控步骤。其作用机制在于染料的磺酸基团与蛋白质碱性氨基酸残基（主要是精氨酸和赖氨酸）通过静电相互作用结合，同时染料分子的芳香环与蛋白质疏水区域发生范德华力作用，形成稳定的蛋白质-染料复合物，在可见光区产生强烈吸收。

       免脱色考马斯亮蓝快速染色液是一种可以在室温下即时染色、无需脱色、无毒无刺激气味的蛋白染液。适用于各种变性及非变性的蛋白质凝胶染色，也可以用于Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的染色，可以节约大量时间，加速实验进程。

ECL化学发光显色

       ECL显色系统代表了免疫印迹检测技术的重大突破，其灵敏度比传统显色法（如DAB）提高1-2个数量级。该系统基于HRP催化H2O2分解产生羟基自由基，这些自由基氧化Luminol使其处于激发态，退激时发射波长为425 nm的光子。增强剂的存在能延长发光时间、增强信号强度（可达1000倍以上），其机制可能涉及氧化中间体的稳定和能量转移过程。

       试剂盒提供“鲁米诺（底物）+ 氧化剂”，HRP 作为催化剂打破反应壁垒，加速鲁米诺氧化→形成高能态鲁米诺→释放光子发光，最终通过仪器检测发光强度，间接反映HRP（及偶联物）的量，实现目标分子的定量/定性分析。

       蛋白免疫印迹凭借其高特异性、灵敏度与可重复性，已成为分子生物学实验室的金标准。从BCA蛋白定量、SDS‑PAGE、考马斯染色、膜转移到ECL显色，每一步都对最终信号的质量产生决定性影响。随着 荧光二抗、数字化成像与自动化工作站的普及，Western Blot正向高通量、低样本量方向演进；同时，微流控芯片与单细胞免疫印迹正在突破传统的样本需求，为细胞异质性研究提供了新工具。未来，结合机器学习的图像分析与多重抗体条带解码，Western Blot有望在临床精准诊断与药物靶点验证中发挥更大价值。