TSA多色免疫荧光技术起源于免疫组织化学与免疫荧光检测灵敏度不足这一长期存在的技术瓶颈。20 世纪90年代初，Bobrow等人首次系统提出并验证了“酪胺信号放大（Tyramide Signal Amplification, TSA）”策略，其核心思想是利用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）催化酪胺类底物在靶分子邻近区域发生共价沉积，从而显著增强检测信号。

       该方法最初应用于免疫组织化学（IHC）和原位杂交（ISH），在低丰度抗原和核酸靶标检测中展现出远高于传统酶显色或直接荧光标记的灵敏度。随着荧光酪胺底物、抗体剥离技术以及显微成像系统的不断成熟，TSA技术逐步从“单靶点信号增强”演进为“多轮标记、空间共存”的多色免疫荧光体系，成为当前组织空间蛋白组学研究中的重要基础方法之一。

蛋白质和酪胺染料反应机理图

核心原理

       TSA是一种基于酶促反应的信号放大方法，核心用于解决免疫检测（如免疫组化、免疫荧光）中靶标分子含量低导致信号弱、难以检出的问题，本质是通过化学级联反应放大报告信号，提升检测灵敏度。

       其核心原理可简化为3步：

       1、特异性结合：标记过氧化物酶（如HRP）的抗体，与样本中的靶标分子（如特定蛋白、核酸）特异性结合，形成靶标-抗体- HRP复合物，这一步和常规免疫检测一致，是信号放大的锚点。

       2、酪胺分子激活与沉积：向体系中加入酪胺分子（一种小分子化合物，可连接荧光素、生物素等报告基团），此时HRP会催化酪胺氧化，使其变成具有活性的自由基态；活性酪胺会快速与周围蛋白质中的氨基酸残基（如色氨酸、组氨酸和酪氨酸）发生共价结合，将大量报告基团沉积在靶标周围。

       3、信号读取与放大效果：最终检测报告基团的信号时，由于靶标周围沉积了远超初始抗体数量的报告分子，信号强度被显著放大，原本看不见的低丰度靶标就能被清晰检出。

优点：

       ①信号放大：HRP‑酪胺循环放大可提升10‑100倍灵敏度，能够检测低丰度蛋白；

       ②共价沉积：荧光酪胺与组织蛋白共价结合，光漂白极低，染色后可长期保存；

       ③多轮剥离‑再标记：在同一切片上可循环去除二抗而不损失已沉积的荧光，突破一抗种属限制，实现4‑8色甚至更多标记；

       ④高空间分辨率：荧光沉积局限于抗原附近，适配共聚焦、光片等高分辨显微技术，提供精准的亚细胞定位；

       ⑤兼容FFPE样本：对福尔马林固定石蜡包埋组织的抗原恢复友好，适用于临床病理和组织芯片。

应用：

       近年来，基于TSA的多色免疫荧光已形成成熟的商业化套件，并在肿瘤免疫微环境、神经科学以及临床病理诊断等前沿研究中得到广泛应用。

1、肿瘤免疫微环境（TIME）空间映射

       众所周知，癌症免疫治疗反应与癌症免疫微环境之间关系的重要性，因此需要对免疫微环境进行深入表征，以识别预后和预测性的免疫生物标志物。通过多重免疫荧光（mIF）进行表型细胞分型是识别活检样本中细胞类型的强大且有用的工具。利用mIF酪胺信号扩增，在单张载玻片上标记多达八个标记的固定、石蜡嵌入肿瘤组织的过程，以识别肿瘤组织中的免疫细胞表型。为了准确解读结果，重要的是识别不同细胞类型上表达的受体及其典型位置（如核细胞、膜和/或细胞质）。mIF技术是发现新型癌症免疫疗法及相关生物标志物的有前景资源。与传统IHC仅允许每个组织样本标记一个标记不同，mIF可以从单个组织样本中检测多个标记，同时提供关于细胞表型组成及其空间定位的广泛信息。

不同肿瘤和上皮抗体染色的肿瘤样本复合体. DOI:10.3389/fmolb.2021.667067

       免疫检查点阻断（ICB）已常规用于膀胱癌的治疗，但大多数患者几乎没有临床获益。使用来自 IMvigor210队列的348份预处理转移性尿路上皮癌样本，筛选出与CD8+ T效应细胞和免疫检查点特征显著相关的重要基因。构建了免疫检查点抑制剂评分（IMS）系统来预测免疫治疗反应性。转录组分析证实，高IMS评分组免疫激活显著，预后更好，免疫治疗反应性更高，是预测ICB预后和反应性的有力生物标志物。筛选出了重要的核心基因作为潜在治疗靶点，并利用基因组学、转录组学、免疫组学等多组学方法对这些基因进行了验证。总之，研究确定了预测膀胱癌患者免疫检查点抑制剂治疗反应性的有效生物标志物，并提供了新的免疫治疗靶点。

枢纽基因的识别与预后评估. DOI:10.1038/s41388-021-02019-6

2、神经突触与神经胶质相互作用的三维重建

       mTLSs是识别且可能对ICIs产生积极反应的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的可靠生物标志物。在深入探究mTLS阳性非小细胞肺癌患者对免疫治疗产生耐药性的原因时，很明显，减轻某些癌症相关成纤维细胞（CAF）群体的有害影响，可能会显著提高mTLS阳性非小细胞肺癌患者免疫治疗的效果。尽管到目前为止，直接靶向成纤维细胞的尝试（如使用FAP导向药物）尚未取得成功，但可以尝试探索其他策略来对抗mTLS阳性非小细胞肺癌中成纤维细胞的促肿瘤活性。通过抑制各种免疫检查点可能是一个有前景的策略，能够更精准地靶向CD8+ T细胞的耗竭。研究评估了PD-L1抑制剂阿替利珠单抗与抗TIGIT药物替雷利珠单抗联合作为晚期mTLS阳性、PD-L1低表达非小细胞肺癌患者一线治疗的效果。

特定CAF亚群在阻止ICIs中的关键作用. DOI:10.1016/j.xcrm.2025.101934

3、抗体剥离（stripping）/低背景优化与高通量自动化

       研究评估了四种抗体剥离策略，用于采用TSA技术的手动多重免疫组织化学（mIHC）检测，包括微波炉辅助抗体去除（MO-AR），作为剥离质量的对照；基于化学试剂的抗体去除（CR-AR），代表一种化学变性方法；以及基于杂交炉的抗体去除，分别在50°C（HO-AR-50）和98°C（HO-AR-98）下进行，这两种方法相对于MO-AR在加热过程和温度上进行了调整。经过仔细评估，成功建立了一种优化的热化学工艺，使用杂交炉在染色循环之间去除抗体复合物，新建立的抗体剥离方案将有助于基于TSA的多重免疫组织化学技术在易碎组织检测中的应用。

使用MO-AR和HO-AR-98进行抗体剥离的mIHC染色比较. DOI:10.1186/s13104-025-07301-4

4、基于FFPE的生物标志物验证与标准化流程构建

       酪胺染色用于多重免疫荧光的优势在于，其与传统免疫组织化学的实验方案极为相似，这使得它既可以在实验台上进行手动染色，也可以使用标准自动染色仪进行自动染色。重要的是，这意味着多重免疫荧光的结果在标记检测的质量和灵敏度方面，能够与常规临床实践中使用的显色免疫组织化学方案所达到的水平相匹配。同样，大多数临床实验室都具备开展多重染色步骤的基本技术设施，这种方法既适用于新鲜/冷冻组织，也适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。

基于荧光的TSA 5至8 plex检测能为成像提供强烈信号. DOI:10.1016/j.modpat.2023.100197

5、低丰度/稀有细胞标志物的敏感检测与神经科学应用

       研究开发了FT-GO（荧光染色酪酰胺-葡萄糖氧化酶）作为一种多重荧光TSA系统。与BT-GO类似，FT-GO涉及过氧化物酶（POD）催化的荧光染色酪酰胺（FT）沉积，其中的过氧化氢（H₂O₂）由葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖过程中产生。将FT-GO应用于免疫荧光（IF）、多重免疫荧光、多重mRNA荧光原位杂交（FISH）组织化学以及使用腺相关病毒（AAV）示踪剂的神经解剖学tract追踪。在每种应用中，FT-GO都能提供信号强且信噪比高的标记。

多重FT-GO荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF）的荧光四重标记. DOI:10.1038/s41598-022-19085-9

6、与其它空间组学技术（IMC、CODEX、MIBI）互补或联合分析

       间接免疫组织化学（IHC）方法的主要优势在于信号增强，因为多种二抗可以与一抗结合，从而提高对低表达抗原的敏感性。21 世纪初，Wählby 等人开发了一种连续免疫荧光染色（SIFS）方案，将染色的组织切片与低pH甘氨酸缓冲液一起孵育，然后进行微波处理，以去除一抗、二抗以及荧光团。在迭代间接免疫荧光成像（4i）中，使用由甘氨酸、尿素、盐酸胍和三（2-羧乙基）膦盐酸盐组成的洗脱缓冲液去除一抗和二抗，通过转盘共聚焦显微镜在亚细胞水平上可检测多达40重靶标。

间接IHC多周期成像工作流程. DOI:10.1038/s41416-024-02882-6

7、异质性亚区（micro-niches）与免疫细胞功能动态

       基于TSA技术开发了多个mIF检测组，用于表征结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤和肺癌中的肿瘤微环境（TME）。相应检测组的染色和扫描完成后，会在图像分析软件上对样本进行分析。随后，每个细胞的空间位置和染色情况会从该定量软件导出到R语言环境中。开发的R脚本不仅能够分析多种肿瘤区域（如肿瘤中心、肿瘤边缘和基质）中每种细胞类型的密度，还能对不同细胞类型之间进行基于距离的分析。这种特定的工作流程为常规用于多种标志物的经典密度分析增添了空间维度。

肝脏结直肠癌转移的图像分析和R点图重建. DOI:10.3791/65220