细胞周期 (cell cycle)是指细胞从上一次分裂完成到下一次分裂结束所经历的全部过程，包括分裂间期和分裂期(M期)，其中分裂间期又可分为DNA合成前期 (G1期)、DNA合成期 (S期)、DNA合成后期(G2期)。G0期是细胞静止期，它们暂时脱离细胞周期，停止细胞分裂，但在一定条件的刺激下，又可重新进入细胞周期进行分裂。

       细胞是生命活动的基本单位，而细胞周期又与细胞的增殖和分化密切相关。细胞内的DNA含量会随细胞周期进程而发生周期性变化，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各阶段的百分比。常用于测定DNA含量的染料有碘化丙啶(PI)、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、7-氨基放线菌素 (7-AAD)、Hoechst 33342、Hoechst 33258等。

流式细胞术PI染色法

       PI是一种红色荧光染料（激发535 nm，发射615 nm），能够嵌入DNA双螺旋的碱基间隙，荧光强度与DNA含量呈正比。PI对双链DNA（dsDNA）具有高亲和力，几乎不受序列偏好限制；但它同样可以与RNA 结合，导致荧光背景升高。因此在细胞周期分析中必须加入RNase处理以去除RNA干扰。

PI结合双链DNA后的荧光激发和发射波长

       通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度可以直接反映细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期，S期和G2/M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。值得注意的是，PI不能通过细胞膜完整的细胞 (如活细胞和早期凋亡细胞)。

       凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化 (DNA fragmentation) 导致部分基因组DNA片段在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。

PI细胞周期检测流式结果分析图

RedNucleus I染色法

       RedNucleus I是一种远红外dsDNA的荧光染料，具有细胞膜透性，可快速进入活细胞和固定细胞特异性结合dsDNA，且无需RNase的消化，结合后的荧光强度和dsDNA的含量成正比。通过流式细胞仪测定细胞内DNA含量，然后根据dsDNA含量的分布情况，进行细胞周期分析。RedNucleus I染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组dsDNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行dsDNA复制的S期细胞的荧光强度为1~2之间。与传统的碘化丙啶染色 (PI Staining) 方法相比，细胞无需破膜或固定，操作更加简便。此外，RedNucleus I与Horizon BV/BUV、FITC和R-PE等染料兼容，可在样品染色后进行周期检测。

RedNucleus I细胞周期检测流式结果分析图

       细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下，通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂系列过程。细胞通过分裂的方式增殖，细胞增殖是生物体的重要生命特征。单细胞生物以细胞分裂的方式产生新个体，多细胞生物以细胞分裂的方式产生新的细胞，从而补充体内衰老和死亡的细胞。检测细胞增殖的方法主要为观察DNA合成含量，例如DNA前体物质（胸腺嘧啶核苷类似物）掺入法，比如BrdU、EdU法等。

DNA合成检测

       BrdU（5-Bromo-2’-deoxuuridine）是胸腺嘧啶的衍生物，可替代胸腺嘧啶选择性整合到新合成的DNA中（细胞周期S期）。这种掺入可以稳定存在，并随着DNA复制进入子细胞中。利用BrdU特异性抗体可以检测掺入的BrdU，进而判断细胞的增殖能力。

       EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）是一种嘧啶类似物，在DNA合成期整合入DNA双链，检测基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃作用发生共价反应形成共价键（EdU是含有炔烃的核苷类似物）。在铜催化反应中，炔与染料标记的叠氮化物反应，形成稳定的共价键。点击法的EdU标记增殖快速有效、易于使用，只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU。

BrdU法和Click-iT EdU法检测原理的比较

       虽然BrdU和EdU两种方法都能检测细胞的增殖能力，但两者也有不同。BrdU抗体较大，必须先对DNA进行部分变性形成单链，才能与BrdU结合进而完成检测；而EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散，无需DNA变性即可有效检测，可有效地避免样品损伤，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

牛肌肉细胞染色

       EdU不仅适用于体外培养的细胞增殖检测，且由于稳定性较好，对活体无明显副作用，也适用各种动物活体注射，将目标组织制备为石蜡或冰冻组织切片后检测。EdU系列适用于小鼠、大鼠及其他动物模型的各种组织器官（血管除外）的细胞增殖检测。

       EdU可通过注射、饮水或局部给药进入动物体内，随后在新合成的DNA中掺入。Click‑iT套件直接对组织切片、全厚标本或冷冻块进行点击反应，无需DNA变性，保持组织形态和抗原表位。Click‑iT EdU系列凭借无DNA 变性、快速点击反应、信号持久稳定的特性，能够在体内实现数天至数十天的持续检测，并兼容多色成像和组织学/流式分析，是对组织或器官整体进行细胞增殖评估的高效、可靠的替代方案。

EdU细胞增殖体内实验流程示意图

0.1mg EdU于100uL PBS腹腔注射小鼠6h后，检测多个器官的细胞增殖情况