Western Blot技术讲解——抗体孵育篇

目的蛋白印迹在膜上，经过封闭之后，印迹目的蛋白与一个或多个抗体孵育。第一个抗体（一抗）与目的蛋白结合，而第二个抗体（二抗）与第一个抗体结合，二抗本身结合有酶或染料，可用来指示蛋白的位置。不过有些一抗也具有直接标记的功能，但使用标记二抗有明显优势。首先不止一个二抗分子能与单个一抗分子结合，可以放大信号；其次，标记的二抗可用于大量不同特异性的一抗，因而无需标记多个一抗。

2、抗体选择：

在对于任何一种目的蛋白，都有不止一种有效抗体。为缩小选择的范围，我们通常要考虑以下几个方面：

文献引用：根据官网了解该抗体发表文献的数量，如果发现该靶点的抗体有多个货号，那么尽可能选择发表文献较多的货号。

反应性：根据自己实验动物的种属性选择合适的抗体，比如，实验动物是小鼠，那么一抗需要选择抗小鼠。

实验应用：根据自己实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择的抗体能够满足多种类型实验，保证抗体的使用价值。

抗体偶联物：标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶（AP）标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。

3、抗体稀释：

按照抗体说明书建议的稀释倍数进行稀释使用，有时一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。一般来说，高倍稀释一抗可减少非特异性信号，高倍稀释酶标二抗可最大限度降低整体的高背景。

4、抗体孵育：

一抗的孵育时间一般是室温2个小时或4℃过夜，主要取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度。一般建议使用较高的抗体稀释倍数结合较长的时间孵育，以保证特异性结合。若孵育时间较长应在4℃过夜进行。

二抗孵育在一抗结束后，TBST洗膜5min以去除残留一抗。孵育一般在室温下1-2h。

5、清洗：

清洗转印膜可从膜上去除未结合的抗体或多余封闭剂，它们会导致高背景和检测不佳。常用清洗缓冲液是含有吐温-20的PBS或TBS稀释液。如前所述，高浓度的去污剂可能会使目的蛋白从膜上洗脱。而对于高度纯化抗体，往往使用不含去污剂的缓冲液进行清洗。

清洗次数和时间根据具体实验来确定，清洗过少会产生过高背景；过度清洗会洗脱目的蛋白或降低信号。建议清洗3-5次，每次5min。