引言

近红外荧光成像凭借组织自发荧光低、穿透深度较可见光区更优的特点，已成为活体临床前研究的重要工具[2]。在众多近红外荧光染料中，花菁类染料Cy7及其磺化衍生物因发射波长位于约770 nm的NIR-I窗口，且水溶性经过磺酸基修饰后显著改善，被广泛用于抗体、多肽及小分子配体的巯基位点标记。磺化Cy7-马来酰亚胺（CAS: 1422279-40-0）即为该类标记的典型试剂：其马来酰亚胺基团在近中性pH条件下与游离巯基（-SH）发生迈克尔加成反应，形成稳定的硫醚键，从而实现共价偶联。

然而，从试剂到可用的荧光标记探针，中间涉及多个方法学决策点：缓冲液组分是否兼容马来酰亚胺的反应活性、染料与蛋白的摩尔比如何确定、游离染料如何有效去除、标记度与荧光亮度之间如何权衡。这些环节的疏漏不仅降低标记效率，还可能在活体成像中引入假阳性信号或加速探针清除。本文聚焦上述实验流程中的技术要点与质控节点，结合近红外荧光探针在活体成像中的一般性方法学共识[2,5,6]，提供可参考的优化策略。需要说明的是，目前直接针对磺化Cy7-马来酰亚胺的系统性方法学研究仍较有限，部分建议基于马来酰亚胺-巯基化学的通用原理与近红外成像的普遍经验，具体实验条件仍需根据标记对象进行个体化验证。

1. 标记反应的化学基础与缓冲体系选择

马来酰亚胺与巯基的反应具有较高的特异性，但其反应速率与选择性受pH、缓冲液种类及共存亲核试剂的影响显著。该反应的适宜pH范围为6.5–7.5：pH过低时巯基以质子化形式存在，亲核性下降；pH过高则马来酰亚胺环易发生水解开环，丧失反应活性，同时蛋白质上的氨基（-NH2）可能参与竞争性副反应。因此，推荐使用磷酸盐缓冲液（PBS）或HEPES缓冲体系，避免使用含游离巯基的还原剂（如DTT、β-巯基乙醇）及含氨基的缓冲液（如Tris），后者可与马来酰亚胺发生竞争反应。

若标记对象为抗体或蛋白，需注意其内部二硫键的还原策略。部分方案采用温和还原剂（如TCEP或二硫苏糖醇）预先暴露巯基，但还原剂必须在标记前通过脱盐柱或透析去除，否则将大量消耗马来酰亚胺染料。对于天然含游离巯基的蛋白，可直接进行标记，但需通过Ellman试剂或类似方法预先定量巯基含量，以指导染料用量。

2. 染料与标记对象的摩尔比优化

摩尔比是影响标记度与产物活性的关键变量。对于抗体标记，文献中常见的染料/蛋白初始摩尔比范围为2:1至10:1，具体取决于目标DOL与抗体巯基数量。摩尔比过低导致标记不足、荧光信号弱；过高则可能引起过度标记，造成抗体亲和力下降或探针聚集。建议在正式实验前进行小规模梯度优化（如2:1、5:1、8:1），标记后测定DOL并评估结合活性（如适用），以确定兼顾荧光亮度与生物功能的折中条件。

对于多肽或小分子配体，由于分子量小、巯基数量有限，摩尔比可适当提高至1:1至3:1（染料:多肽），但需注意游离染料去除的难度随染料过量程度增加而上升。磺化Cy7-马来酰亚胺的水溶性较好，在 aqueous 缓冲液中不易聚集，这为较高摩尔比下的均相反应提供了有利条件，但仍需通过纯化步骤严格控制游离染料残留。

3. 标记后纯化与游离染料去除

标记反应结束后，游离染料必须有效去除，否则将在活体成像中产生高背景信号，甚至被误判为靶向富集。常用的纯化方法包括脱盐柱（如Sephadex G-25）、透析、超滤及尺寸排阻色谱（SEC）。对于抗体-染料偶联物，脱盐柱或超滤（截留分子量30–50 kDa）通常足以去除大部分游离染料；对于小分子或多肽偶联物，透析或反相HPLC可能更为必要。

纯化效果的验证可通过测定纯化产物的吸光度光谱进行：磺化Cy7在约750 nm处有特征吸收峰，蛋白质在280 nm处有吸收。若纯化后A750/A280比值异常偏高或纯化产物在薄层色谱/高效液相色谱中显示游离染料峰，则提示去除不彻底。需注意，磺化Cy7的磺酸基团可能影响其在某些反相色谱柱上的保留行为，方法开发时需予以考虑。

4. 标记度（DOL）的测定与荧光亮度评估

DOL通常通过分光光度法估算：利用染料在750 nm处的摩尔吸光系数（需查阅产品批次分析证书或可靠文献值）与蛋白质在280 nm处的吸光系数，结合染料在280 nm处的校正因子进行计算。由于不同蛋白质的280 nm吸光系数差异较大，且磺化Cy7在280 nm处有不可忽略的吸收，校正因子的准确性直接影响DOL计算结果。建议在相同缓冲液中测定游离染料与偶联物的吸收光谱，以实验方式确定校正因子，而非直接套用通用值。

DOL并非越高越好。对于抗体类探针，DOL过高（如>6）可能导致荧光自淬灭、抗体聚集或清除加速。一般认为DOL在2–4范围内可在荧光亮度与生物活性之间取得较好平衡，但该范围需根据具体抗体和成像模型验证。对于小分子配体，DOL通常接近1，此时荧光亮度主要取决于染料的量子产率与环境敏感性。磺化Cy7的荧光对pH相对稳定，但在极端酸性或存在某些金属离子时可能发生变化，活体成像前宜在模拟生理条件下确认荧光特性。

5. 光稳定性与聚集行为的质控要点

NIR-I成像常需较长的曝光时间或较高的激发功率，染料的光稳定性直接影响定量可靠性。磺化Cy7-马来酰亚胺在避光、干燥、-20℃条件下保存时稳定性较好，但标记产物在光照下的降解速率可能因偶联环境而异。建议在标记后对产物进行短时光照稳定性测试（如连续激发5–10分钟，监测荧光强度衰减），以评估是否需要在成像时降低激发功率或使用抗淬灭措施。

聚集行为是另一个易被忽视的质控点。磺化修饰显著降低了Cy7的疏水性聚集倾向，但在高浓度或高盐条件下，偶联物仍可能形成聚集体，导致荧光自淬灭和活体分布改变。动态光散射（DLS）或分析型SEC可用于监测聚集状态。若发现聚集，可考虑添加少量非离子表面活性剂或优化缓冲液盐浓度，但需注意这些添加剂对活体成像的潜在影响。

6. 与近红外成像实验的衔接及方法学局限

标记产物的表征数据（DOL、荧光光谱、聚集状态）应作为活体成像实验设计的前置依据。例如，若DOL偏低，可能需要提高注射剂量以补偿信号强度，但这可能引入剂量相关的非特异性分布；若游离染料去除不彻底，则背景信号升高，可能掩盖靶向信号。近红外荧光探针在膀胱癌和胃癌模型中的成像研究[5,6]表明，探针的理化性质与给药途径共同决定了成像对比度，这提示标记产物的质控不应仅关注荧光强度，还需兼顾药代动力学相关的理化参数。

需要明确指出的是，目前检索到的近红外成像文献中，直接使用磺化Cy7-马来酰亚胺进行系统性方法学优化的报道较为有限。多数近红外荧光探针研究采用其他染料或纳米探针体系[1,3,5,6]，其标记流程不能直接迁移至本试剂。因此，本文所述流程基于马来酰亚胺-巯基化学的通用原则与近红外成像的一般经验，具体参数（如缓冲液组成、摩尔比、纯化方式）需根据标记对象和实验目的进行预实验确定。此外，NIR-II成像技术的发展[2]虽拓展了成像窗口，但磺化Cy7的发射波长位于NIR-I，其在深层组织成像中的穿透深度限制仍是方法学上需要正视的边界。

结语

磺化Cy7-马来酰亚胺的巯基标记是一个涉及化学、光谱学与成像方法学的多环节过程。从缓冲体系选择、摩尔比优化、纯化方案确定到DOL与光稳定性质控，每一步均影响最终探针的可用性。本文梳理的实验流程与质控节点旨在为研究者提供可操作的参考框架，但需强调个体化验证的必要性。随着近红外荧光成像在活体研究中的深入应用[2,5,6]，标记试剂的标准化表征与批次一致性控制将愈发重要，这也对实验记录与数据报告的规范性提出了更高要求。

参考文献

• Fluorescence-free near-infrared nanoprobes for in vivo resonant Raman imaging

Guowei Fu, Jin Li · Chemical Engineering Journal · 2025

DOI: 10.1016/j.cej.2025.167709

产品相关性评分: 27/100

关联性分析: 该文献标题为'无荧光近红外纳米探针用于体内共振拉曼成像'，核心是无荧光（fluorescence-free）纳米探针与共振拉曼成像，而非使用Cy7马来酰亚胺类荧光染料进行巯基标记。目标产品磺化Cy7-马来酰亚胺是一种近红外荧光染料-巯基反应试剂，其核心用途是荧光标记与成像；而本文明确采用'无荧光'策略，与产品的荧光成像定位存在根本性冲突。摘要缺失，无法确认文中是否提及或使用该化合物或其直接衍生物，从标题判断极不可能真正使用目标产品，故化合物匹配度极低。应用场景虽涉及近红外与体内成像，但为拉曼成像而非荧光成像，仅部分契合。实验模型（体内成像）与产品预期活体成像领域有部分重叠，但检测模态不同。方法学严谨性因摘要为空、无光谱/标记效率/细胞毒性等关键表征数据可评估，给低分。期刊Chemical Engineering Journal为高影响力期刊（h-index 385），研究创新性较好，故影响力得分中等偏上。总体而言，该文献与目标产品相关性弱，不建议作为该化合物的应用参考文献。

• Near-infrared II fluorescence imaging

Nature Reviews Methods Primers · 2024

DOI: 10.1038/s43586-024-00309-3

产品相关性评分: 36/100

关联性分析: 该文献为Nature Reviews Methods Primers上关于近红外二区（NIR-II）荧光成像的综述/方法指南，主题与近红外荧光成像相关，但目标产品磺化Cy7-马来酰亚胺的发射波长约773 nm，属于NIR-I窗口，与NIR-II（通常>1000 nm）成像范畴存在明显波段差异，应用场景仅部分契合。文献未明确提及或研究磺化Cy7-马来酰亚胺或其直接衍生物，也未提供该化合物的光谱、标记效率、细胞毒性或光稳定性等表征数据，化合物匹配度与方法严谨性评分低。作为高影响力期刊的方法学综述，研究影响力评分较高。总体而言，该文献与目标产品相关性较弱，不宜作为该化合物的直接应用或表征依据。

• Rational Design of a Small Molecular Near-Infrared Fluorophore for Improved In Vivo Fluorescence Imaging

Gayoung Jo, Yoonbin Park, Min Ho Park, Hoon Hyun · Materials · 2023

DOI: 10.3390/ma16227227

产品相关性评分: 27/100

关联性分析: 该文献设计并开发了一种新型小分子近红外荧光染料SMF800，并非使用目标产品磺化Cy7-马来酰亚胺（CAS: 1422279-40-0）或其直接衍生物。SMF800虽同为近红外荧光染料，但属于不同化学结构，因此化合物匹配度极低。应用场景方面，文献涉及活体荧光成像（骨和肿瘤靶向），与产品描述的活体成像应用有一定契合。实验模型使用小鼠活体成像，与产品预期应用领域部分一致。但文献未提供目标化合物的任何光谱数据、标记效率或细胞毒性等关键表征，方法学严谨性得分低。期刊Materials为中等影响力期刊，研究创新性一般。总体相关性较低，主要因未使用目标化合物。

• A tandem near-infrared fluorescence complementation system with enhanced fluorescence for imaging protein–protein interactions in vivo

Minghai Chen, Chuang Yan, Yingxin Ma, Xian-En Zhang · Biomaterials · 2021

DOI: 10.1016/j.biomaterials.2020.120544

产品相关性评分: 50/100

关联性分析: 该文献标题描述了一种串联近红外荧光互补系统用于活体成像蛋白质-蛋白质相互作用，但摘要和关键词缺失，无法确认是否明确使用或研究了目标化合物磺化Cy7-马来酰亚胺。考虑到近红外荧光互补系统可能涉及Cy7类染料，但更可能使用其他近红外荧光蛋白或染料，化合物匹配度较低。应用场景（活体成像蛋白质相互作用）与产品描述的部分应用（活体成像、蛋白质标记）有一定相关性，但并非直接针对马来酰亚胺标记巯基的典型应用。实验模型可能涉及细胞或动物，与产品预期应用领域部分一致，但信息不足。数据与方法严谨性无法评估，因缺乏摘要和具体表征数据。期刊Biomaterials影响力较高，但文献本身创新性一般。总体相关性较低，需进一步获取全文确认染料使用情况。

• In Vivo Optical Imaging of Bladder Cancer Tissues in an MB49 Bladder Cancer Orthotopic Mouse Model Using the Intravesical or Intravenous Administration of Near-Infrared Fluorescence Probe

Katsunori Teranishi · International Journal of Molecular Sciences · 2023

DOI: 10.3390/ijms24032349

产品相关性评分: 42/100

关联性分析: 该文献使用的近红外荧光探针ASP5354并非目标化合物磺化Cy7-马来酰亚胺，也未提及其为直接衍生物，仅同属近红外荧光染料类别，因此化合物匹配度极低。应用场景为膀胱癌活体光学成像，与产品描述的活体成像应用有一定相关性，但产品核心应用还包括抗体/蛋白标记等，文献未涉及。实验模型为MB49膀胱癌原位小鼠模型，与产品预期用于活体动物成像的领域基本一致。方法学上仅描述了ASP5354的成像效果，未提供目标化合物的光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键表征数据，严谨性不足。期刊为International Journal of Molecular Sciences，影响因子和引用潜力中等，研究具有一定创新性但非目标化合物相关。整体评分较低，主要因文献未真正使用目标化合物。

• In vivo near-infrared fluorescence imaging of gastric cancer in an MKN-45 gastric cancer xenograft mouse model using intraoperative ureteral identification agent ASP5354

Katsunori Teranishi · Photochemical & Photobiological Sciences · 2023

DOI: 10.1007/s43630-023-00410-8

产品相关性评分: 36/100

关联性分析: 该文献研究的是ASP5354（一种用于术中输尿管识别的近红外荧光剂），并非磺化Cy7-马来酰亚胺。ASP5354虽为近红外荧光探针，但其化学结构未在标题/摘要中明确为Cy7马来酰亚胺衍生物，且文献未提及使用目标化合物或其直接衍生物，因此化合物匹配度极低。应用场景为活体近红外荧光成像，与产品描述的活体成像应用有一定契合；动物模型为胃癌皮下移植瘤小鼠，与产品预期生物医学成像领域部分一致；但文献未提供该化合物的光谱、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键表征数据（摘要为空，信息有限），方法学严谨性评分低。期刊影响力中等，创新性一般。总体相关性较低。