1 引言

远红光至近红外（NIR）荧光染料已成为化学生物学与分子影像学中不可或缺的工具。相较于可见光区染料，远红光激发与发射窗口（约630–700 nm）能够显著降低生物样品的自发荧光背景，同时提高光在组织中的穿透深度，并匹配常见激光器（633 nm或647 nm）与CCD/CMOS检测器的高灵敏响应区间。花菁染料Cyanine 5（Cy5）因其较高的摩尔吸光系数与良好的荧光量子产率，长期以来是这一波段的主力荧光团之一。然而，未经修饰的Cy5骨架疏水性强，在水相体系中易发生聚集，导致荧光猝灭并增加非特异性吸附，这在其用于蛋白质等生物大分子标记时尤为突出。

磺化策略通过在花菁骨架的吲哚环上引入磺酸基团（–SO₃⁻），大幅提升染料的水溶性并降低其与生物分子的疏水相互作用。磺化Cy5（sulfo-Cy5）保留了Cy5的核心光谱特征，同时具备极佳的水相分散能力，使其成为抗体、多肽与核酸标记的优选荧光团。其N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化酯形式可与伯胺（主要为赖氨酸侧链ε-氨基及蛋白N端）在温和条件下形成稳定的酰胺键，是生物偶联中最经典的化学反应之一。近年来，基于磺化Cy5的荧光探针在G蛋白偶联受体（GPCR）配体开发、免疫检查点抗体示踪、肽靶向成像以及细菌代谢标记等方向取得了一系列进展，凸显了该类试剂在基础研究与转化医学中的桥梁作用。本文围绕磺化Cy5-NHS活化酯的化学与光物理基础，结合最新文献报道，评述其应用前沿与现存挑战。

2 磺化Cy5的光物理与化学基础

2.1 光谱性质与仪器兼容性

磺化Cy5的光谱行为与母体Cy5高度相似，其吸收与发射峰位于远红光区，可使用633 nm或647 nm激光激发，并通过Cy5或APC滤光片组进行检测。这一特性使其能够无缝整合到绝大多数流式细胞仪、共聚焦显微镜与荧光酶标仪的光学配置中，无需对仪器进行硬件改造。与此同时，远红光区较低的自发荧光背景与较高的信噪比，使其在复杂生物样品（如全血、组织匀浆）中的检测灵敏度优于可见光区染料。需要指出的是，现有文献多聚焦于探针整体的生物学评价，对磺化Cy5本身的光谱参数（如摩尔吸光系数、量子产率）与光稳定性缺乏系统报道，这在一定程度上限制了对标记探针荧光性能的精确归因。

2.2 水溶性优势与标记化学

磺化Cy5的突出优势在于其水溶性。产品资料显示其极易溶于水，同时易溶于甲醇、DMF等有机溶剂，这为偶联反应提供了灵活的溶剂选择空间。在标记蛋白质时，高水溶性意味着染料可在纯水相缓冲液中以较高浓度分散，避免因染料聚集导致的标记效率下降与蛋白变性风险。相比之下，非磺化Cy5-NHS在标记反应中常需引入少量有机助溶剂（如DMF），可能对蛋白构象产生扰动。

NHS酯与伯胺的反应在pH 7.2–8.5范围内效率较高，生成稳定的酰胺键，副产物NHS可通过透析或凝胶过滤去除。该反应的选择性较好，主要修饰暴露于蛋白表面的赖氨酸残基。然而，标记程度（degree of labeling, DOL）需通过实验优化：过高的染料/蛋白比可能导致蛋白聚集、活性位点遮蔽或荧光自猝灭，过低则信号不足。现有应用文献虽报道了探针的成功制备，但普遍未系统披露DOL、纯化后回收率及标记对蛋白活性的影响，这些方法学细节的缺失值得后续研究补足。

3 前沿应用进展

3.1 GPCR配体荧光探针的开发

GPCR是药物发现中最重要的靶点家族之一，其配体结合与受体 trafficking 的可视化研究依赖于高亲和力、高稳定性的荧光配体。近期，针对神经降压素受体1（NTS1R）的研究报道了磺化Cy5标记的肽类配体探针，该探针在流式细胞术竞争结合实验中展现出亚纳摩尔级亲和力（Ki约0.094 nM），并在人血浆中表现出优异的稳定性（半衰期远大于48小时），成功用于活细胞共聚焦成像与肿瘤组织成像[1]。类似地，神经肽Y Y4受体（Y4R）的环肽荧光配体亦采用磺化Cy5作为荧光报告基团，结合流式细胞术、荧光各向异性、NanoBRET及单受体分子追踪等多种技术，实现了对受体结合动力学与膜扩散行为的定量解析[3]。这些工作表明，磺化Cy5标记不会显著破坏肽配体的受体结合活性，且其远红光信号适用于长时程活细胞成像。值得注意的是，上述研究均未单独表征磺化Cy5的光稳定性与细胞毒性，而这两项参数对于长时间活细胞追踪实验至关重要，未来需在探针开发中予以系统评估。

3.2 抗体标记与活体多尺度成像

抗体-染料偶联物是免疫荧光与活体成像的核心试剂。一项针对治疗性抗PD-L1抗体的研究采用磺化Cy5通过肽段偶联策略实现抗体标记，并在4T1肿瘤小鼠模型中开展了全身荧光成像与显微成像，结合免疫组化共定位验证了探针的特异性[4]。该工作凸显了磺化Cy5在抗体标记中的适用性：良好的水溶性有助于维持抗体稳定性，远红光信号则支持较深的组织穿透。然而，抗体标记的批次一致性、染料/抗体比与体内药代动力学的关联仍需更系统的研究。此外，该研究未专门比较磺化Cy5与其它NIR染料（如Alexa Fluor 647或IRDye 680）在抗体偶联中的性能差异，此类对照实验对于指导染料选择具有实际价值。

3.3 肽靶向探针与活体荧光成像

在肿瘤靶向与血管成像方向，磺化Cy5标记的CTHRSSVVC肽探针被用于体外流式细胞术、免疫荧光及4T1荷瘤小鼠活体光学成像，文献报道其肿瘤/正常组织比值可达7.21±1.44，标记肽纯度超过99%[6]。另一项研究将磺化Cy5标记的CXCR4靶向肽MK007应用于Barrett食管小鼠模型的近红外荧光内窥镜成像与离体宽场成像，展示了该染料在黏膜病变检测中的潜力[5]。这些应用共同说明，磺化Cy5-NHS活化酯作为肽N端或赖氨酸侧链的标记试剂，能够为靶向探针提供稳定的远红光信号。但需注意，活体成像的信号强度受组织吸收、散射与探针药代动力学共同影响，染料本身的荧光量子产率并非唯一决定因素；现有文献多报道探针层面的结果，对染料光物理性质与成像质量之间的定量关系尚缺乏深入分析。

3.4 代谢标记与化学生物学拓展

除NHS酯偶联外，磺化Cy5的衍生物亦被用于化学生物学标记策略。例如，DBCO-sulfo-Cy5通过叠氮-炔环加成反应标记代谢掺入的叠氮-D-赖氨酸，实现了对益生菌活力的光学分析[2]。尽管该研究使用的是点击化学衍生物而非NHS活化酯，但其共享磺化Cy5荧光核心，反映了该染料平台的可拓展性。对于NHS活化酯而言，其直接应用仍集中于氨基标记；未来可探索将磺化Cy5-NHS预标记于氨基修饰的寡核苷酸或糖胺聚糖，以拓展其在核酸与细胞外基质研究中的应用。

4 局限性与挑战

尽管磺化Cy5-NHS活化酯在多项前沿研究中展现出良好性能，现有证据仍存在若干局限。首先，多数应用文献将染料视为“工具”而非研究对象，缺乏对磺化Cy5光谱性质、光稳定性、pH稳定性与细胞毒性的系统表征，这使得不同研究间的荧光信号难以直接比较。其次，NHS酯标记的位点异质性可能导致探针批次间性能波动，而现有报道鲜有披露DOL与纯化细节。第三，活体成像中探针的药代动力学与染料的水溶性、电荷性质密切相关，磺化基团虽改善水溶性，但也可能改变探针的血浆蛋白结合与清除速率，相关构效关系尚不清晰。第四，当前文献涉及的靶点与模型仍较有限，主要集中在GPCR配体、抗体与少数肽探针，需在更多生物体系中验证其普适性。

5 展望

未来，磺化Cy5-NHS活化酯的发展可从以下方向推进：其一，建立标准化的染料表征流程，包括吸收/发射光谱、荧光量子产率、光漂白速率与细胞毒性，为探针设计提供可靠参数；其二，发展位点特异性标记策略（如酶催化偶联或非天然氨基酸引入），以降低标记异质性对探针性能的影响；其三，结合高分辨率显微技术与在体成像手段，系统评估磺化Cy5探针在长时程追踪中的稳定性；其四，拓展其在核酸标记、活细胞表面工程与多模态成像中的应用。随着这些问题的逐步解决，磺化Cy5-NHS活化酯有望在化学生物学与分子影像学之间发挥更为关键的桥梁作用。

参考文献

• High-Affinity and Proteolytically Stable Peptidic Fluorescent NTS1R Ligands.

Fabian J Ertl, Anna Friedel, Elena J Schmid, Carina Höring, Nataliya Archipowa, Pierre Koch, Simone Maschauer, Roger J Kutta, Olaf Prante, Max Keller · Journal of medicinal chemistry · 2025

DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5c01701

产品相关性评分: 82/100

关联性分析: 文献明确合成了sulfo-Cy5标记的NTS1R配体探针21（sulfo-Cy5-labeled probe 21），直接使用了目标化合物磺化Cy5-NHS活化酯作为荧光标记试剂，化合物匹配度高。应用场景涉及流式细胞术竞争结合实验、活细胞共聚焦成像及肿瘤组织成像，与产品描述中蛋白/多肽标记、细胞成像等应用高度契合。实验模型包括表达NTS1R的活细胞和肿瘤组织，与产品预期生物应用领域一致。方法学上提供了Ki值（0.094 nM）和人血浆稳定性数据（t1/2 >> 48 h），但未提供sulfo-Cy5的光谱表征、标记效率或细胞毒性等染料本身的关键数据，严谨性中等偏上。期刊为J. Med. Chem.（高影响力），研究创新性强，但发表时间短尚无引用数据。综合评分82分。

• Metabolic labeling of peptidoglycan enabled optical analysis of probiotic vitality.

Xinping Hu, Qirong Xiong, Shuai Hou, Hongwei Duan · Analytical methods : advancing methods and applications · 2024

DOI: 10.1039/d4ay00982g

产品相关性评分: 48/100

关联性分析: 文献使用DBCO-sulfo-Cy5（磺化Cy5的叠氮反应衍生物）通过点击化学标记代谢掺入的叠氮-D-赖氨酸，从而分析益生菌活力。该化合物与目标产品磺化Cy5-NHS活化酯在反应基团（NHS酯 vs DBCO）和标记对象（氨基 vs 叠氮）上不同，但共享磺化Cy5荧光核心，属于直接衍生物范畴，故化合物匹配度中等偏低。应用场景为细菌代谢标记与活力检测，与产品分类描述的蛋白/抗体/核酸标记及细胞成像等典型应用契合度较低。实验模型为益生菌（细菌），与产品预期应用领域（哺乳动物细胞、蛋白标记等）部分不一致。文献未提供该染料的光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键表征，方法学严谨性一般。期刊为分析化学领域专业期刊，研究创新性中等，影响力有限。

• Illuminating Neuropeptide Y Y4 Receptor Binding: Fluorescent Cyclic Peptides with Subnanomolar Binding Affinity as Novel Molecular Tools.

Jakob Gleixner, Sergei Kopanchuk, Lukas Grätz, Maris-Johanna Tahk, Tõnis Laasfeld, Santa Veikšina, Carina Höring, Albert O Gattor, Laura J Humphrys, Christoph Müller, Nataliya Archipowa, Johannes Köckenberger, Markus R Heinrich, Roger Jan Kutta, Ago Rinken, Max Keller · ACS pharmacology & translational science · 2024

DOI: 10.1021/acsptsci.4c00013

产品相关性评分: 84/100

关联性分析: 该文献明确使用了Sulfo-Cy5标记的Y4R环肽配体（化合物16-19之一），Sulfo-Cy5即为目标产品的荧光基团，属于目标化合物的直接衍生物应用，而非仅提及同类染料。应用场景涵盖流式细胞术、荧光各向异性、NanoBRET及单受体分子追踪成像，与磺化Cy5-NHS用于蛋白/多肽标记及生物成像的产品定位高度契合。实验模型为NPY Y4受体表达体系及放射性配体竞争结合、饱和结合和动力学实验，与产品标记多肽/蛋白的预期应用领域一致。文献提供了pKi、pKd、结合动力学等定量数据，方法学严谨，但未专门表征Sulfo-Cy5的光谱性质、标记效率或光稳定性。期刊为ACS Pharmacology & Translational Science，影响力中等偏上，创新性较好。综合评分为84分。

• Multiscale imaging of therapeutic anti-PD-L1 antibody localization using molecularly defined imaging agents.

Iris M Hagemans, Peter J Wierstra, Kas Steuten, Janneke D M Molkenboer-Kuenen, Duco van Dalen, Martin Ter Beest, Johan M S van der Schoot, Olga Ilina, Martin Gotthardt, Carl G Figdor, Ferenc A Scheeren, Sandra Heskamp, Martijn Verdoes · Journal of nanobiotechnology · 2022

DOI: 10.1186/s12951-022-01272-5

产品相关性评分: 83/100

关联性分析: 文献明确使用了sulfo-Cy5（磺化Cy5）作为近红外荧光染料，通过肽段偶联到抗PD-L1抗体上，用于多尺度成像。虽然未明确说明是NHS活化酯形式，但sulfo-Cy5是目标化合物的直接染料部分，且用于抗体标记（与NHS酯标记氨基的用途一致），因此化合物匹配度较高。应用场景涉及抗体标记、荧光成像（全身和显微成像），与产品分类描述的蛋白/抗体标记及荧光成像高度相关。实验模型使用4T1肿瘤小鼠模型，与产品预期应用领域（体内外成像）一致。文献提供了生物分布、荧光成像、免疫组化共定位等数据，但未专门表征sulfo-Cy5的光谱或稳定性等，方法学严谨性较好。期刊为Journal of Nanobiotechnology，影响力较高。总体相关性较强。

• CXCR4 peptide-based fluorescence endoscopy in a mouse model of Barrett's esophagus.

Sabrina Marcazzan, Marcos J Braz Carvalho, Matthias Konrad, Julia Strangmann, Anna Tenditnaya, Theresa Baumeister, Roland M Schmid, Hans-Jürgen Wester, Vasilis Ntziachristos, Dimitris Gorpas, Timothy C Wang, Margret Schottelius, Michael Quante · EJNMMI research · 2022

DOI: 10.1186/s13550-021-00875-7

产品相关性评分: 72/100

关联性分析: 该文献明确使用了Sulfo-Cy5标记的CXCR4靶向肽（MK007），其中Sulfo-Cy5即为目标化合物磺化Cy5的染料部分，但并非直接使用磺化Cy5-NHS活化酯，而是其与肽偶联后的衍生物，故化合物匹配度较高但非完全一致。应用场景为近红外荧光内窥镜成像和离体宽场成像，属于活体/离体荧光成像，与产品描述中荧光显微镜、标记蛋白/多肽等应用有部分重叠，但产品分类描述更侧重标记试剂而非内窥镜成像。实验模型为Barrett食管小鼠模型，与产品预期应用领域（细胞/分子标记）有一定距离，但涉及多肽标记和体内成像，模型匹配度中等。文献提供了靶本比、共定位等数据，但未专门表征磺化Cy5-NHS的光谱、标记效率或细胞毒性等关键参数，方法严谨性一般。期刊为EJNMMI Research，影响因子中等，研究创新性尚可，但非高影响力期刊。总体相关性中等偏上。

• Repurposing an atherosclerosis targeting peptide for tumor imaging.

Luciana Kovacs, Ryan A Davis, Tanushree Ganguly, Roger Chammas, Julie L Sutcliffe · Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie · 2022

DOI: 10.1016/j.biopha.2021.112469

产品相关性评分: 80/100

关联性分析: 该文献明确使用磺化Cy5（sulfo-Cy5）对CTHRSSVVC肽进行N端标记，并以此探针开展体外流式细胞术、免疫荧光及小鼠4T1肿瘤活体光学成像，与目标产品磺化Cy5-NHS活化酯的氨基标记用途及远红光活体/细胞成像应用高度契合。文献提供了标记肽的纯度（>99%）及体内肿瘤/正常组织比值（7.21±1.44）等数据，但未系统表征该染料的吸收/发射光谱、光稳定性或细胞毒性，方法学严谨性中等。期刊为Biomedicine & Pharmacotherapy，研究具有一定创新性但影响力中等。总体相关性较高。