1 引言

线粒体不仅是细胞能量代谢的中心，更是凋亡调控、氧化应激感知与钙稳态维持的关键细胞器。线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, ΔΨm）由呼吸链质子泵产生的电化学梯度形成，其动态变化直接反映线粒体能量状态与完整性。在多种病理条件下——包括代谢性疾病、缺血再灌注损伤、神经退行性疾病及肿瘤发生发展——ΔΨm的异常去极化或超极化往往是线粒体功能障碍的早期事件[4,5]。因此，实现对活细胞线粒体膜电位的灵敏、特异的可视化检测，对于解析疾病机制与药物筛选具有重要价值。

在众多线粒体荧光探针中，Mito-Tracker Red CMXRos（又称CMXRos，CAS: 167095-09-2）因其独特的化学结构而区别于依赖单纯电荷吸附的探针。CMXRos是一种X-rosamine衍生物，含有一个弱巯基反应性的氯甲基基团，可在膜电位驱动的线粒体富集之后与线粒体蛋白的巯基形成共价连接，从而在细胞固定和通透处理后仍保留部分荧光信号。这一特性使其在需要后续免疫荧光共定位或多色标记的实验场景中具有不可替代的优势。本文围绕CMXRos的化学与光谱基础，结合近期文献中涉及线粒体功能评估的研究，综述其在不同生物学领域的应用进展与技术要点。

2 CMXRos的化学机制与光谱特性

2.1 膜电位依赖的线粒体富集与共价锚定

CMXRos分子式为C32H32Cl2N2O，分子量531.5，呈红色荧光，最大激发波长579 nm，最大发射波长599 nm。作为一种亲脂性阳离子染料，CMXRos可被动扩散穿过质膜，并依据Nernst方程在线粒体基质中富集，其聚集程度与ΔΨm成正比。与Rhodamine 123或JC-1类似，CMXRos的线粒体染色依赖于活细胞维持的膜电位，因此不能用于固定或通透后的细胞染色。

然而，CMXRos的独特之处在于其氯甲基官能团。该基团具有温和的巯基反应性，可在富集后与线粒体蛋白（尤其是富含巯基的蛋白）形成共价硫醚键。这一共价锚定使得CMXRos在后续醛类固定剂（如多聚甲醛）和去垢剂（如Triton X-100）处理时，荧光信号不会完全消失，尽管强度可能下降约2–10倍。这一特性使其适用于需要固定后成像的实验流程，例如与抗体标记的线粒体蛋白或非线粒体标志物进行双标共定位分析。

2.2 光谱兼容性与多色标记潜力

CMXRos的激发与发射光谱位于红色通道（~579/599 nm），与常见的绿色荧光探针（如FITC、Alexa Fluor 488、GFP）光谱重叠较少。这一光谱分离特性使其非常适合与绿色通道探针联合使用，实现线粒体与目标蛋白、细胞器或离子指示剂的双色或多色成像。在需要同时评估线粒体膜电位与其他细胞功能指标（如活性氧、钙离子浓度或凋亡标志物）的研究中，CMXRos提供了便利的光谱窗口。

3 线粒体膜电位检测在疾病机制研究中的应用进展

3.1 代谢性疾病与糖尿病肾损伤

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病的主要微血管并发症之一，肾小管上皮细胞损伤与线粒体氧化应激在其发病中起核心作用。Ganoderic acid A（GAA）在链脲佐菌素诱导的糖尿病肾损伤模型中表现出保护作用，其机制与减轻线粒体氧化应激及调控TGF-β/Smad信号通路相关[1]。在此类研究中，评估线粒体膜电位的稳定性是判断肾小管上皮细胞线粒体功能是否恢复的关键指标。CMXRos凭借其膜电位依赖性的染色特点，可用于检测GAA干预后肾小管细胞ΔΨm的恢复情况，从而将线粒体功能改善与组织保护效应直接关联。

3.2 肿瘤药理学与线粒体凋亡通路

在肿瘤药物重定位研究中，线粒体途径凋亡的激活常伴随ΔΨm的显著下降。Labetalol在A375黑色素瘤细胞中展现出细胞毒性，并诱导线粒体相关的凋亡信号[3]。此类研究通常需要区分早期凋亡（ΔΨm去极化但质膜完整）与晚期凋亡/坏死（质膜完整性丧失）。CMXRos的活细胞染色特性使其能够在质膜完整性丧失前特异性标记线粒体，结合其他凋亡标志物（如Annexin V、caspase激活探针）可实现凋亡进程的精细解析。此外，在磁性氧化铁纳米颗粒对A704肾癌细胞生物效应的比较研究中[2]，线粒体功能评估同样是判断纳米材料生物安全性与治疗潜力的重要维度，CMXRos可作为线粒体膜电位变化的读出工具。

3.3 心血管与肺损伤中的线粒体质量控制

线粒体损伤与清除失衡是缺血再灌注损伤、心肌梗死等心血管病理的核心环节。Mic60/Mitofilin抑制剂Miclxin通过抑制受损线粒体的清除诱导H9C2心肌成肌细胞死亡[4]，该过程涉及线粒体膜电位的持续恶化与线粒体自噬通路的阻断。在此类研究中，CMXRos可用于追踪药物处理后心肌细胞ΔΨm的动态变化，区分线粒体去极化与线粒体质量控制的关联。

在早产儿高氧肺损伤模型中，SIRT1及其SUMO化修饰通过改善线粒体生物发生与融合发挥保护作用[5]。线粒体融合与生物发生通常伴随膜电位的恢复与线粒体网络的重塑。CMXRos的红色荧光信号可用于评估肺泡上皮细胞或肺成纤维细胞在SIRT1调控下线粒体膜电位的改变，为线粒体质量控制机制提供可视化证据。

3.4 生殖医学与精子质量评估

精子质量评估中，线粒体膜电位是反映精子活力与受精潜力的重要功能参数。膜结合RAGE被鉴定为低质量精子的稳定生物标志物[6]，而精子线粒体功能状态与RAGE表达之间的关系值得进一步探索。CMXRos可用于精子线粒体膜电位的活细胞染色，结合RAGE免疫标记，有助于在单细胞水平解析精子线粒体功能与膜表面标志物表达的关联。需要注意的是，精子细胞结构特殊，染色条件（浓度、时间、温度）需针对不同物种进行优化。

4 实验设计与技术考量

4.1 固定与通透对荧光信号的影响

尽管CMXRos的共价锚定使其能够耐受固定和通透，但荧光强度下降2–10倍是必须纳入考量的现实问题。在需要固定后成像的实验中，建议：(1) 在染色阶段适当提高CMXRos工作浓度（在推荐50–200 nM范围内偏向高限）；(2) 固定时间不宜过长，多聚甲醛固定后充分洗涤；(3) 若信号下降严重影响检测，可考虑在固定前完成图像采集，或改用不依赖固定步骤的活细胞成像方案。对于仅需活细胞线粒体标记的实验，则无需固定，可直接在生理条件下观察。

4.2 膜电位依赖性染色的局限

CMXRos仅对具有生物活性的线粒体染色，这一特性既是其优势也是其局限。在ΔΨm严重去极化的细胞中，CMXRos的富集减少，可能导致信号减弱甚至假阴性。因此，在评估线粒体膜电位下降时，需设置适当的阳性对照（如已知去极化剂）并结合细胞活力指标，以区分“膜电位下降”与“细胞死亡导致的探针无法加载”。此外，CMXRos的氯甲基基团可与巯基反应，在高浓度或长时间孵育时可能对细胞产生一定毒性，实验需优化浓度与时间以平衡信号强度与细胞健康。

4.3 多色标记与光谱补偿

CMXRos与绿色荧光探针的光谱重叠较少，但在多色实验中仍需注意荧光补偿与通道设置。建议使用单标对照进行补偿设置，并优先选择发射峰远离599 nm的绿色探针（如Alexa Fluor 488，发射峰~519 nm）。若与远红外探针联合使用，需确认检测通道之间无显著串扰。

5 结语与展望

Mito-Tracker Red CMXRos凭借膜电位依赖的线粒体富集与弱巯基反应性共价锚定的双重机制，在活细胞线粒体标记与固定后成像之间取得了独特的平衡。近年来，从糖尿病肾损伤、肿瘤凋亡信号、心血管线粒体质量控制到肺损伤修复与精子质量评估，线粒体膜电位作为功能读出指标贯穿多个研究领域[1-6]。CMXRos的红色荧光光谱与固定兼容性使其在多色、多步骤实验流程中具有实用价值。未来，随着对线粒体异质性、亚细胞定位与动态调控研究的深入，CMXRos有望与更高分辨率的成像技术、活细胞动态追踪及多参数分析平台结合，为线粒体生物学与相关疾病机制研究提供更精细的工具支持。实验者需充分理解其膜电位依赖性染色与固定后信号衰减的特性，通过严谨的对照设计与条件优化，确保结果的可靠性与可重复性。

参考文献

• Ganoderic acid A attenuates streptozotocin-induced diabetic kidney injury: associations with mitochondrial oxidative stress and TGF-β/Smad signaling.

Hetian Fang, Rui Wang · American journal of translational research · 2026

DOI: 10.62347/KOTD1718

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• Comparative Physicochemical Characterization and Biological Effects of Magnetite- and Maghemite-Based Magnetic Colloidal Suspensions in A704 Renal Cancer Cells.

Mihai Cristian Neagu, Diana Haj Ali, Emil Radu Iacob, Andreea Smeu, Roxana Stoicescu, Călin Marius Popoiu, Georgiana Boştinaru, Ştefan Marcu, Robert Ianoş, Vlad Socoliuc, Lucian Barbu Tudoran, Elena-Alina Moacă · Pharmaceuticals (Basel, Switzerland) · 2026

DOI: 10.3390/ph19091381

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• Preclinical Evaluation of Labetalol for Cutaneous Melanoma Drug Repurposing: Cytotoxic Activity in A375 Cells and Mitochondria-Associated Apoptotic Signaling.

Richard Dahma, Elena-Alina Moacă, Iasmina-Alexandra Predescu, Ana-Cristiane Dragomir, Oana-Andrada Iftode, Stela Iurciuc, Diana Haj Ali, Ioana Macaşoi, Maria Sala-Cîrtog, Iulia-Najette Crintea, Alina-Doina Tănase, Marilena Dinuţi · Medicina (Kaunas, Lithuania) · 2026

DOI: 10.3390/medicina62091802

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• Mic60/Mitofilin inhibitor, Miclxin, induces rat H9C2 cardiomyoblast death by inhibiting the removal of damaged mitochondria.

Muhammad S Khan, Somayyeh Nasiripour, Michele Oyarzabal, Swati Banerjee, Kumar Sharma, Manzoor A Bhat, Jean C Bopassa · American journal of translational research · 2025

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• SIRT1 and its SUMOylation attenuate hyperoxia-induced lung injury by improving mitochondrial biogenesis and fusion.

Kun Yang, Qinxin Zheng, Mei Luo, Rong Zhang, Shuai Zhao, Lan Kang, Xiaoping Lei, Wenbin Dong · Free radical biology & medicine · 2025

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• Membrane-bound receptor for advanced glycation end products (RAGE) is a stable biomarker of low-quality sperm.

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