1 引言

生物发光成像与检测技术因其无需外源激发光、背景信号极低的特点，在分子生物学、细胞生物学及分析化学领域占据独特地位。萤火虫荧光素酶（firefly luciferase, Luc）催化的ATP依赖性氧化脱羧反应是应用最为广泛的生物发光体系之一，其天然底物D-荧光素（D-luciferin）在ATP、Mg²⁺和分子氧存在下被氧化为氧化荧光素，伴随560 nm左右的黄绿色光发射。D-荧光素钠盐（CAS 103404-75-7）作为水溶性改良形式，在体外报告基因检测与活体生物发光成像中均具有广泛适用性。近年来，随着荧光素酶工程改造、底物类似物设计以及多模式传感策略的快速发展，基于D-荧光素的生物发光体系正从传统的报告基因工具向高灵敏诊断、环境监测和即时检测（POCT）等方向拓展。本文围绕该体系的最新研究进展，从催化机制、报告基因应用、ATP生物发光传感以及底物与酶的协同工程等角度展开论述，并对当前局限与未来方向作出评述。

2 催化机制与底物化学基础

萤火虫荧光素酶属于酰基-腺苷酸形成酶超家族，其催化过程分为两步：首先D-荧光素在ATP存在下被腺苷化生成荧光素酰-腺苷酸中间体，随后该中间体在分子氧参与下发生氧化脱羧，形成激发态氧化荧光素并释放光子。该反应的光输出在底物过量条件下与荧光素酶浓度呈正比，这一定量关系构成了报告基因检测的物理化学基础。D-荧光素钠盐相较于游离酸形式具有更高的水溶性和更快的溶解速率，便于在生理缓冲体系中直接配制使用。值得注意的是，反应体系的pH、ATP浓度、Mg²⁺水平以及温度均对发光强度和持续时间产生显著影响，其中ATP既是底物也是限速因素之一，这一特性使该体系天然适用于ATP定量检测。

从底物化学角度看，D-荧光素的苯并噻唑环与噻唑啉环结构决定了其发光波长和反应活性。近年来，研究者通过修饰苯环或噻唑环上的取代基，开发了一系列发射波长红移或动力学性质改变的底物类似物，以期改善组织穿透深度或适配特定荧光素酶变体。然而，底物类似物往往以牺牲催化效率为代价换取光谱优势，如何在发光强度与波长之间取得平衡仍是底物工程的核心挑战。

3 报告基因检测与活体生物发光成像

luc基因作为报告基因在基因表达调控研究、RNA干扰验证、信号通路活性分子筛选等领域应用广泛。基于D-荧光素的化学发光检测几乎无背景信号，使其在低丰度表达检测中具有显著优势。在标准荧光计数仪中，该体系可可靠检测到皮克级以下的荧光素酶，这一灵敏度水平是传统显色或荧光报告基因难以企及的。

在活体层面，生物发光成像依赖底物在体内的分布、代谢动力学与酶表达水平的耦合。近期一项关于牙龈卟啉单胞菌诱导ATR激活促进食管鳞癌进展的研究中，研究者采用D-荧光素钾盐（150 mg/kg腹腔注射）进行小鼠皮下移植瘤模型的体内生物发光成像[1]。尽管该研究使用的是钾盐而非钠盐，但两者化学本质相同、仅反离子不同，其体内应用逻辑对D-荧光素钠盐具有直接参考价值。需要指出的是，该文献未报告底物的光谱表征、标记效率或细胞毒性数据，方法学严谨性有限，且期刊影响力处于中等水平。这提示在活体成像研究中，底物的药代动力学参数（如腹腔注射后的峰值时间、组织分布）对定量结果的可靠性具有重要影响，而现有文献对此类关键参数的报道仍不充分。

4 ATP生物发光传感与病原检测

ATP是所有活细胞的核心能量货币，其生物发光定量依赖于荧光素酶-D-荧光素体系对ATP的严格依赖性。近年来，该原理被广泛应用于食品和环境样品中活菌的快速检测。例如，一项研究构建了噬菌体修饰的智能水凝胶搅拌棒，实现了直接视觉比色筛查与ATP生物发光定量的双模式细菌检测[2]。该工作明确使用D-荧光素与荧光素酶联用进行ATP生物发光信号采集，应用场景与D-荧光素钠盐的产品定位高度契合，但文献未明确标注所用D-荧光素的盐形式，亦未提供底物的光谱或稳定性表征数据。

在另一项针对金黄色葡萄球菌的检测研究中，研究者将噬菌体裂解酶CBD结构域的特异性识别与ATP生物发光相结合，在牛奶、鸡肉和小龙虾尾等食品基质中实现了活菌的灵敏检测[5]。该研究给出了检测范围与检出限等方法学参数，但同样未对D-荧光素本身的光谱特性或储存稳定性进行表征。此外，基于噬菌体修饰透明水凝胶的多重细菌同时检测平台也采用了类似的ATP生物发光策略[6]。这些工作共同表明，D-荧光素作为ATP生物发光检测的通用底物，其分析性能在很大程度上取决于样品前处理（如ATP提取效率、胞外ATP去除）和酶制剂的稳定性，而非底物本身的创新。

值得关注的是，一项基于Photobacterium leiognathi与D-荧光素修饰金丝网印刷电极的电化学生物发光传感器研究，将D-荧光素直接固定于电极表面用于盐水中烃类污染物的检测[3]。该工作拓展了D-荧光素的应用形态（从溶液底物到界面修饰组分），但其应用方向偏离了报告基因与ATP检测的核心场景，且缺乏底物修饰密度与发光响应之间关系的系统表征。

5 荧光素酶工程与底物协同优化

底物的效用并非孤立存在，而是与荧光素酶的催化性能紧密耦合。近年来，通过定向进化改善荧光素酶的热稳定性、底物亲和力与发光动力学，成为拓展D-荧光素应用边界的重要途径。一项针对Photuris pennsylvanica荧光素酶的研究通过工程化改造获得了热稳定性显著提升的变体Ppe146-LGR，其在37°C下对D-荧光素和ATP的催化效率分别提高约3.8倍和3.7倍，发光波长约580 nm，最适pH与热稳定性（Tm约75.3°C）等关键参数得到系统表征，并在细菌快速检测和报告基因分析中进行了验证[4]。该研究发表于International Journal of Biological Macromolecules，具有较高的影响力。这一案例说明，酶变体的性能提升可以部分弥补底物在特定环境（如高温、复杂基质）下的局限性，但同时也对底物的批次一致性和纯度提出了更高要求。

从协同优化角度看，未来底物设计应更多考虑与工程化酶变体的匹配性，例如针对红移发光变体开发相应的底物类似物，或针对耐热酶优化底物在高温下的化学稳定性。当前文献中，针对D-荧光素钠盐本身的光稳定性、氧化敏感性及长期储存稳定性的系统研究仍较为缺乏，这构成了该领域的一个明显知识缺口。

6 局限性与展望

综合近期文献可以看出，D-荧光素作为生物发光体系的底物，其应用场景已从经典的报告基因检测扩展至ATP传感、病原快速筛查和环境监测等多个方向。然而，现有研究存在若干共性局限：其一，多数应用性文献仅将D-荧光素作为商品化试剂使用，缺乏对底物盐形式、纯度、光谱特性及稳定性的表征，导致不同研究之间的可比性受限；其二，活体成像研究中底物的给药方案（剂量、途径、时间窗口）差异较大，缺乏标准化的药代动力学指导；其三，底物类似物的开发与荧光素酶工程之间的协同设计尚处于起步阶段，系统性构效关系数据不足。

展望未来，以下几个方向值得关注：一是发展适用于深层组织成像的红移底物与配套酶变体，同时保持可接受的催化效率；二是建立针对D-荧光素钠盐的标准化质量控制指标，包括光谱纯度、氧化杂质含量与储存稳定性；三是将D-荧光素体系与微流控、纸基分析器件及智能手机成像等POCT平台深度集成，推动其在资源有限场景中的落地应用。随着底物化学与酶工程的协同进步，基于D-荧光素的生物发光技术有望在灵敏度、稳定性和场景适应性方面实现新的突破。

参考文献

• Pg-Induced ATR Activation Promotes ESCC Progression via M2 TAM Polarization.

Yanhua Sun, Lin Yang, Xiaodong Wei · Journal of oral pathology & medicine : official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology · 2026

DOI: 10.1111/jop.70157

产品相关性评分: 61/100

关联性分析: 文献在体内生物发光成像中使用了D-荧光素钾盐（150 mg/kg腹腔注射），而非目标产品D-荧光素钠盐。两者均为萤火虫荧光素酶底物，化学本质相同（仅反离子不同），属于直接同类底物但非目标化合物本身，故化合物匹配度中等。应用场景为小鼠活体生物发光成像，与产品分类描述中的荧光素酶底物报告基因检测高度契合。实验模型为BALB/c小鼠皮下移植瘤模型，与活体成像预期应用一致。但文献未提供D-荧光素的光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键表征，方法学严谨性较低。期刊为口腔病理学领域中等水平期刊，研究创新性一般，影响力有限。总体而言，文献确实使用了荧光素酶底物进行活体成像，但使用的是钾盐而非钠盐，且缺乏化合物表征数据。

• An In Situ Dual-Mode Bacterial Detection Technique Allowing Both Direct Visual Colorimetric Screening and ATP Bioluminescence Quantification via an Intelligent Phage-Modified Hydrogel Stir Bar.

Cong Cao, Rong Feng, Zhenzhong Yu, Ning Gan, Keqi Tang · Analytical chemistry · 2026

DOI: 10.1021/acs.analchem.6c02372

产品相关性评分: 75/100

关联性分析: 该文献明确在ATP生物发光检测体系中使用了D-luciferin（与荧光素酶联用），与目标产品D-Luciferin sodium的直接底物应用高度匹配，但未明确标注为钠盐形式，故化合物匹配度略扣分。应用场景为ATP生物发光传感检测，与产品分类描述中'荧光素酶用于ATP检测'高度契合。实验模型为细菌检测体系，虽非哺乳动物细胞或活体成像模型，但属于荧光素酶报告基因/ATP检测的典型应用领域，匹配度良好。方法学上仅提及使用D-luciferin和荧光素酶进行生物发光反应，未提供该化合物的光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键表征数据，严谨性一般。期刊为Analytical Chemistry（高影响力分析化学期刊），研究创新性较好（双模式检测平台），研究影响力较高。总体而言，文献真正使用了目标化合物（D-luciferin）作为ATP生物发光检测的底物，应用场景与产品描述高度一致。

• Bioluminescence-based electrochemical sensor for dual-mode direct hydrocarbon detection in saline water utilizing Photobacterium leiognathi and d-luciferin-modified au-SPE.

Arash Rasti, Muhamad Afiq Aziz, Zaira Zaman Chowdhury, Sook Mei Khor · Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands) · 2026

DOI: 10.1016/j.bioelechem.2026.109233

产品相关性评分: 53/100

关联性分析: 该文献明确使用D-luciferin（目标化合物）修饰金丝网印刷电极，用于构建基于细菌生物发光的电化学传感器，因此化合物匹配度中等偏上（14分），但并非研究该化合物本身的荧光/发光性质或作为荧光素酶底物的经典报告基因应用。应用场景为环境污染物检测（烃类污染），与产品分类描述的荧光素酶报告基因、基因表达检测、ATP检测等核心应用场景差异较大，仅ATP依赖性电子释放与ATP检测有间接关联，故应用场景相关性较低（9分）。实验模型为Photobacterium leiognathi细菌及海水/盐水体系，与产品预期的哺乳动物细胞、动物活体成像或体外报告基因检测体系不匹配（8分）。方法学上提供了电化学表征（CV）和生物发光响应数据，但缺乏该化合物关键的光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等荧光染料表征，严谨性一般（12分）。期刊Bioelectrochemistry为中等影响力期刊，研究创新性尚可但引用潜力有限（10分）。总体而言，文献确实使用了目标化合物，但应用方向偏离产品核心定位。

• Engineering a thermophilic luciferase variant from Photuris pennsylvanica into a mesophilic-like enzyme for expanded applications potential.

Yong Xu, Yu Bai · International journal of biological macromolecules · 2025

DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.139605

产品相关性评分: 86/100

关联性分析: 该文献研究以D-荧光素（D-luciferin）为底物的荧光素酶变体Ppe146-LGR，属于目标产品D-Luciferin sodium的直接应用场景。文献明确以D-luciferin作为底物测定催化效率（37°C下对D-luciferin和ATP的催化效率分别提高3.8倍和3.7倍），并验证了其在细菌快速检测和报告基因分析中的应用，与产品分类描述（荧光素酶底物、报告基因、ATP检测）高度契合。实验模型包括细菌检测体系和报告基因分析，与产品预期应用领域一致。数据与方法方面，文献提供了发光波长（580 nm）、最适pH、热稳定性（Tm 75.3°C）及催化效率等关键表征，但未专门针对D-Luciferin sodium本身提供光谱或稳定性数据（因其为底物而非被研究染料）。期刊为International Journal of Biological Macromolecules（H指数263，2年引用指数6.775），影响力较高。总体而言，该文献真正使用了D-荧光素作为底物，应用场景与产品高度相关，但研究核心是酶变体而非底物本身，故化合物匹配度略低于满分。

• Phage LysSA163-CBD mediated specific recognition coupled with ATP bioluminescence for the sensitive detection of viable Staphylococcus aureus in food matrices.

Peng Guan, Ruining Li, Yifeng Ding, Chenxi Huang, Jia Wang, Hui Pan, Yanchun Shao, Xiaohong Wang · Analytica chimica acta · 2024

DOI: 10.1016/j.aca.2024.343248

产品相关性评分: 78/100

关联性分析: 文献明确使用D-Luciferin作为萤火虫荧光素酶ATP生物发光检测的底物，与目标产品（D-Luciferin sodium，萤光素酶底物）高度匹配。应用场景为ATP生物发光传感检测，直接契合产品分类描述中'荧光素酶还用于ATP的检测'。实验模型涉及金黄色葡萄球菌及食品基质（牛奶、鸡肉、小龙虾尾），虽非典型哺乳动物细胞或活体成像模型，但属于ATP检测的合理应用体系。方法学上提供了检测范围、LOD、特异性等数据，但未对D-Luciferin本身的光谱特性、稳定性或细胞毒性进行表征，严谨性一般。期刊Analytica Chimica Acta为分析化学领域权威期刊，研究具有较好的应用创新性和引用潜力。

• Phage-Modified Clear Hydrogel for Simultaneous Detection of Multiple Bacteria.

Cong Cao, Qianfeng Yu, Zhenzhong Yu, Keqi Tang, Ning Gan · Analytical chemistry · 2024

DOI: 10.1021/acs.analchem.4c03465

产品相关性评分: 暂不可用（备用分非真实AI评分）

关联性分析: 尚未完成有效分析。