引言

荧光点亮适配体（fluorogenic aptamers, FLAPs）是一类能够特异性结合非荧光或弱荧光小分子染料并使其荧光显著增强的核酸序列。自2011年Spinach适配体与DFHBI染料组合被报道以来，FLAPs已成为活细胞RNA标记与生物传感的重要工具[1]。然而，第一代DFHBI染料存在荧光亮度有限、光稳定性不足等缺陷，限制了其在动态成像和高灵敏度检测中的应用。DFHBI-1T（CAS: 1539318-36-9）作为DFHBI的衍生物，通过引入噻吩基团等结构修饰，在保持低背景荧光的同时显著提高了与适配体结合后的荧光量子产率和光稳定性，成为当前Broccoli、Spinach2等优化适配体的常用配体。

近年来，随着适配体定向进化技术、DNA纳米技术和无标记传感策略的快速发展，基于DFHBI-1T的FLAP系统在多个前沿方向取得了重要突破。本文将从RNA团簇可视化、适配体高通量优化、DNA纳米结构信号增强以及多功能生物传感四个维度，系统梳理DFHBI-1T相关研究的最新进展，并探讨其未来发展趋势。

RNA团簇的可视化与定量

RNA团簇（RNA clusters）是由多价分子间RNA-RNA相互作用驱动的无膜凝聚体，可在体外无蛋白质条件下形成。传统研究主要依赖化学探针和计算模拟预测RNA团簇的形成与结构，但缺乏实时、可视化的定量手段。近期，研究者开发了基于分裂Broccoli RNA报告系统的策略，用于体外RNA团簇中分子间碱基配对的视觉化与定量分析[1]。该工作将Broccoli适配体分裂为两个片段，分别标记于目标RNA分子上，当RNA分子间发生碱基配对形成团簇时，分裂的Broccoli片段重新组装并与DFHBI-1T结合，产生荧光信号。这一策略实现了对RNA团簇形成过程的实时监测和定量评估，为理解RNA凝聚体的组装机制提供了有力工具。DFHBI-1T在此类应用中展现出良好的信噪比和光稳定性，使得长时间动态成像成为可能。

适配体定向进化与性能优化

荧光点亮适配体的性能提升依赖于序列空间的系统筛选。传统方法受限于通量和筛选效率，难以在短时间内获得高性能变体。近期，研究者将荧光点亮适配体的优化与大规模并行测序平台相结合，建立了高通量适配体性能评估方法[3]。该策略通过构建大规模适配体变体文库，利用测序深度定量评估各变体与DFHBI-1T等染料的结合能力和荧光激活效率，从而快速识别高亮度、低背景的优化序列。这一方法为Broccoli等适配体的进一步定向进化提供了高效平台，有望推动DFHBI-1T配套适配体在灵敏度和特异性方面的持续提升。

值得注意的是，适配体优化不仅关注荧光亮度，还需兼顾体内稳定性、折叠效率和背景荧光等多维指标。DFHBI-1T相较于第一代DFHBI在光稳定性方面的改善，为适配体筛选提供了更宽的动态窗口，使得高通量筛选中的信号区分度更高。

DNA纳米结构辅助的信号增强

尽管FLAPs具有高信噪比优势，但单个适配体-染料复合物的荧光亮度有限，难以满足低丰度靶标检测和超分辨成像的需求。将RNA发光适配体锚定于DNA纳米结构上，是实现荧光信号增强的有效策略[6]。研究者通过设计DNA折纸或框架核酸结构，将多个Broccoli适配体以可控间距排列，形成局部高密度的染料结合位点。DFHBI-1T分子与适配体结合后，在纳米结构限域空间内产生协同荧光增强效应，显著提高了单位靶标的荧光输出。

该策略的核心优势在于DNA纳米结构的高度可编程性，能够精确控制适配体的空间排布和化学计量比，从而优化荧光增强效果。同时，DFHBI-1T的小分子特性使其能够快速扩散进入纳米结构内部并与适配体结合，避免了传统荧光蛋白标记中体积位阻的问题。这一方向为FLAPs在低丰度RNA检测和高分辨成像中的应用开辟了新途径。

无标记生物传感与多功能检测

基于DFHBI-1T的FLAP系统在生物传感领域展现出广泛的应用前景。研究者建立了无标记、turn-on型荧光生物传感器，用于T4多核苷酸激酶（T4 PNK）活性的高灵敏检测[2]。该传感器利用DNA模拟绿色荧光蛋白（DNA mimic GFP）的适配体结构，当T4 PNK催化DNA磷酸化反应后，适配体构象发生变化，与DFHBI-1T的结合能力增强，从而产生荧光信号。该方法无需标记任何荧光基团，操作简便，为激酶活性检测提供了新思路。

此外，基于DNA适配体模拟GFP的turn-on传感策略也被用于次氯酸（HClO）的检测[5]。通过设计对HClO响应的构象开关适配体，DFHBI-1T的荧光信号与靶标浓度呈正相关，实现了对活性氧物种的选择性响应。在离子检测方面，研究者开发了Pb2+特异性的DNA G-四链体模拟红色荧光蛋白的传感器，该工作虽以红色荧光蛋白模拟为焦点，但其设计理念对DFHBI-1T基绿色荧光传感体系的离子耐受性优化具有借鉴意义[4]。上述研究表明，DFHBI-1T不仅适用于RNA成像，还可作为通用信号报告模块，与多种识别元件偶联，构建多功能传感平台。

挑战与展望

尽管基于DFHBI-1T的FLAP系统取得了显著进展，但仍面临若干挑战。首先，染料在复杂生物环境中的非特异性吸附和背景荧光仍是限制检测灵敏度的关键因素。其次，适配体在活细胞内的折叠效率和稳定性受多种因素影响，如何确保其在生理条件下的性能一致性仍需深入研究。第三，现有多数传感策略的响应速度和可逆性尚不能满足实时动态监测的需求。

未来发展方向可能包括：（1）结合高通量筛选与机器学习，加速DFHBI-1T配套适配体的定向进化[3]；（2）利用DNA纳米结构的可编程性，构建多色、多靶标同时检测的FLAP阵列[6]；（3）开发响应型染料衍生物，拓展DFHBI-1T在微环境传感中的应用范围；（4）推动FLAP系统与超分辨成像技术的融合，实现亚细胞结构的精细解析。随着这些方向的持续推进，DFHBI-1T有望在化学生物学和分子诊断领域发挥更加重要的作用。

结论

DFHBI-1T作为第二代荧光点亮适配体配体，凭借其优异的光物理性能和良好的生物相容性，已成为RNA成像和生物传感领域的核心工具之一。从RNA团簇的动态可视化到适配体的高通量优化，从DNA纳米结构辅助的信号增强到多功能无标记传感，基于DFHBI-1T的FLAP系统不断拓展其应用边界。尽管在背景抑制、胞内稳定性和实时监测等方面仍存在挑战，但随着适配体工程和纳米技术的协同发展，DFHBI-1T相关技术有望在基础研究和临床诊断中实现更广泛的应用。

参考文献

• Visualization and Quantification of Intermolecular RNA Base Pairing in in vitro RNA Clusters Using Split Broccoli RNA Reporters.

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DOI: 10.3791/70886

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关联性分析: 尚未完成有效分析。

• Label-Free Fluorescent Detection of T4 PNK Using a DNA Mimic Green Fluorescent Protein-Based Turn-On Biosensor.

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DOI: 10.1007/s10895-026-04820-6

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• Fluorogenic Aptamer Optimization on a Massively Parallel Sequencing Platform.

Yu-An Kuo, Yuan-I Chen, Naseem Siraj, Yujie He, Zhenglin Yang, Yanxing Wang, Emile J Batchelder-Schwab, Zeynep Korkmaz, Siem Yonas, Trung D Nguyen, Soonwoo Hong, Anh-Thu Nguyen, Sohyun Kim, Saeed Seifi, Po-Hsun Fan, Yuting Wu, Hung-Wen Liu, Yi Lu, Pengyu Ren, Chengde Mao, Hsin-Chih Yeh · ACS sensors · 2026

DOI: 10.1021/acssensors.5c04046

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• A Pb2+-specific DNA G-quadruplex mimic of red fluorescent protein with a monovalent cation ion tolerance.

Jiahuan Zhou, Qiyao Chen, Sihui Huang, Yang Zhang, Shijie Pan, Shenqi Wang, Dandan Wang, Xiaoshun Zhou, Yong Shao · Journal of inorganic biochemistry · 2026

DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2026.113342

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关联性分析: 尚未完成有效分析。

• A sample fluorescent probe based on DNA aptamer mimic of GFP for "turn-on" sensing of ClO.

Haisheng Liu, Hongyu Wang, Jianting Liu, Yaru Zhao, Wen Lu · Spectrochimica acta. Part A, Molecular and biomolecular spectroscopy · 2026

DOI: 10.1016/j.saa.2025.126941

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• Scaffolding Light-Up Aptamers on DNA Nanostructures for Fluorescence Enhancement.

Luyao Shen, Donglei Yang, Daniel Fu, Pengfei Wang, Yonggang Ke · ACS biomaterials science & engineering · 2025

DOI: 10.1021/acsbiomaterials.5c00228

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