1 引言

近红外（NIR）荧光成像因其组织自发荧光低、穿透深度较大和信噪比高等优势，已成为肿瘤术中导航与活体成像研究的热点方向[5]。在众多近红外荧光团中，吲哚菁绿（indocyanine green, ICG）是少数获得临床批准的近红外荧光染料之一，其吸收与发射均位于近红外窗口（约780–820 nm），且具有较高的摩尔吸光系数和良好的生物相容性。然而，游离ICG缺乏靶向特异性，在体内主要经肝胆清除，血浆半衰期短，且浓度依赖地发生聚集导致荧光淬灭，这些固有缺陷严重限制了其在靶向诊断与治疗中的直接应用。

为赋予ICG靶向能力，研究者通常将其与靶向配体（抗体、亲和体、多肽、小分子抑制剂等）共价偶联，构建“靶向-成像”一体化探针。在众多偶联化学中，NHS活化酯（N-hydroxysuccinimide ester）化学因其反应条件温和、偶联效率高、操作简便，成为蛋白质与多肽标记中最常用的生物正交策略之一[6]。ICG NHS活化酯（ICG-OSu）正是基于这一策略设计的ICG衍生物：其分子中的NHS酯基团在弱碱性条件下可与靶向分子表面的伯氨基（主要为赖氨酸残基的ε-氨基及N端氨基）发生亲核取代反应，形成稳定的酰胺键，从而实现ICG对靶向分子的共价标记。本文围绕ICG NHS活化酯的化学特性及其在近红外荧光探针构建中的最新研究进展进行综述，重点讨论其与亲和体、抗体等靶向配体偶联后的肿瘤成像与光热治疗应用，并分析该策略面临的关键挑战与发展方向。

2 NHS活化酯的胺反应化学与ICG衍生物的设计逻辑

2.1 NHS酯的偶联反应机制

NHS酯的胺反应化学基于亲核酰基取代机理。在pH 7.5–8.5的缓冲体系中，靶向分子表面的伯氨基以未质子化形式存在，其孤对电子攻击NHS酯的羰基碳，形成四面体中间体，随后NHS作为离去基团被释放，最终生成稳定的酰胺键。该反应无需催化剂，在室温或4℃下即可进行，且对蛋白质构象和功能影响较小，因而被广泛用于抗体-荧光团、抗体-药物偶联物的制备[6]。值得注意的是，NHS酯在中性至弱碱性水溶液中易发生水解而失活，因此标记反应通常需在无水有机溶剂（如DMF、DMSO）中溶解ICG NHS酯后缓慢加入水相蛋白溶液，并严格控制反应时间与pH。

2.2 ICG NHS活化酯的分子特征

ICG NHS活化酯（CAS: 1622335-40-3）是在ICG母核结构基础上引入NHS酯基团而成的衍生物，呈绿色固体，易溶于DMF等有机溶剂，需避光、干燥、-20℃保存以维持其反应活性。与游离ICG相比，ICG NHS活化酯保留了ICG的近红外荧光特性，同时获得了对氨基的共价反应能力，使其成为构建靶向近红外探针的通用“砌块”。需要指出的是，ICG母核的聚甲川链结构对光、热和氧化较为敏感，标记产物的光稳定性与储存稳定性仍需在具体应用体系中加以验证。

3 ICG NHS活化酯在靶向荧光探针构建中的研究进展

3.1 亲和体介导的靶向成像与光热治疗

亲和体（Affibody）是一类基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域工程化改造而成的小分子支架蛋白，分子量约6–7 kDa，具有亲和力高、组织穿透快、免疫原性低等优势，是构建靶向探针的理想配体。近年来，多项研究利用ICG NHS活化酯与亲和体的氨基共价偶联，构建了多种靶向近红外探针。

针对人表皮生长因子受体2（Her2）阳性肿瘤，研究者将Her2特异性亲和体ZHer2:2891与ICG偶联，构建了ICG-二聚体Her2亲和体偶联物，用于Her2阳性肿瘤的荧光成像与光热治疗[2]。该研究显示，二聚化设计可提高探针的结合亲和力与肿瘤滞留时间，而ICG的引入则赋予探针近红外成像与光热转换的双重功能。类似地，针对Her3阳性肿瘤，Her3特异性亲和体介导的ICG靶向递送显著增强了光热治疗对Her3阳性肿瘤的疗效[4]，表明ICG NHS活化酯化学可灵活适配不同靶点的亲和体配体，形成“一靶一探针”的模块化构建策略。

在免疫检查点靶向方向，研究者构建了ICG标记的PD-L1拮抗亲和体二聚体（ZPD-L1），用于肿瘤成像与光热-免疫协同治疗[1]。该工作将ICG的成像与光热功能同PD-L1阻断的免疫治疗功能整合于单一分子探针，体现了ICG NHS活化酯化学在多功能诊疗一体化探针设计中的潜力。上述研究共同表明，ICG NHS活化酯与亲和体的偶联策略具有通用性强、可模块化组合的特点，为不同分子靶点的近红外探针开发提供了高效路径。

3.2 抗体与小分子探针的标记拓展

除亲和体外，ICG NHS活化酯亦可用于抗体等含氨基生物大分子的标记。NHS酯化学是抗体制备荧光偶联物的经典方法，其与IgG抗体赖氨酸残基的反应可实现每个抗体分子上荧光团数量的调控[6]。然而，抗体分子量大、组织穿透较慢，且ICG的疏水性可能导致偶联物聚集，因此在该类应用中需优化标记比（dye-to-antibody ratio）以平衡荧光亮度与药代动力学。

在小分子探针方向，近红外二区（NIR-II）荧光引导手术的研究展示了靶向小分子探针在肝癌术中导航中的应用潜力[5]。尽管该研究并非直接采用ICG NHS活化酯，但其体现的“靶向配体-近红外荧光团”偶联逻辑与NHS酯化学一脉相承，提示ICG NHS活化酯化学可借鉴小分子探针的设计思路，拓展至更丰富的靶点空间。此外，pH响应性递送策略（如pHLIP介导的细胞内递送）与NHS酯偶联化学的结合，也为ICG探针的微环境响应性激活提供了可能[3]。

4 关键挑战与局限

尽管ICG NHS活化酯在靶向探针构建中展现出显著优势，该策略仍面临若干关键挑战。其一，ICG母核的光稳定性有限，在持续光照下易发生光漂白与光降解，影响长时间成像与重复治疗的可靠性。其二，NHS酯与蛋白质表面多个赖氨酸残基的非选择性反应可能导致偶联位点异质性，进而影响探针的结合亲和力与批次间重现性；位点特异性标记策略（如引入非天然氨基酸或酶催化偶联）有望弥补这一不足[6]。其三，ICG的疏水性易导致偶联物在生理条件下发生自聚集，引起荧光淬灭并改变体内分布，需通过连接臂设计或亲水性修饰加以改善。其四，目前多数研究仍处于临床前阶段，ICG NHS活化酯偶联物的体内安全性、免疫原性与药代动力学数据尚不充分，向临床转化仍需系统评估。此外，本文所引研究多聚焦于特定靶点与模型，ICG NHS活化酯化学在不同靶向配体与疾病模型中的普适性仍需更多直接证据支持。

5 展望

展望未来，ICG NHS活化酯化学的发展可能沿以下方向推进。第一，向近红外二区（NIR-II）拓展：通过结构修饰将ICG衍生物的发射红移至NIR-II窗口，可进一步提升成像深度与分辨率，而NHS酯化学可作为通用偶联工具快速构建NIR-II靶向探针库。第二，诊疗一体化：将ICG的荧光成像与光热治疗功能同免疫治疗、化疗等功能模块整合，构建多功能偶联物，已在PD-L1靶向亲和体研究中初见端倪[1]。第三，偶联化学的精准化：发展位点特异性标记与可控标记比策略，结合NHS酯化学的高效性，可望在保持探针功能的同时提高批次重现性[6]。第四，临床转化研究：系统开展ICG NHS活化酯偶联物的药代动力学、毒理学与早期临床验证，是推动该技术从实验室走向临床的关键。

综上，ICG NHS活化酯作为ICG的胺反应性衍生物，为靶向近红外荧光探针的构建提供了高效、通用且可模块化的化学工具。随着偶联化学的精准化与成像窗口的红移，该策略有望在肿瘤精准诊断与光热-免疫协同治疗中发挥更大作用。

参考文献

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