1 引言

自Alexa Fluor系列染料问世以来，基于罗丹明骨架的磺化荧光团因其优异的光稳定性和水溶性，已成为生物标记领域的标杆工具。AF594 NHS活化酯（CAS 295348-87-7）作为该系列的重要成员，其最大激发/发射波长位于594/613 nm，处于红色光谱窗口，可有效规避生物样本的自发荧光干扰，并具备较深的组织穿透潜力。该试剂通过NHS酯基团与蛋白质、多肽等生物分子上的伯胺（如赖氨酸残基的ε-氨基）发生亲核取代反应，形成稳定的酰胺键，从而实现共价标记。近年来，随着多模态成像和超分辨显微技术的快速发展，对荧光探针的性能要求日益严苛，AF594 NHS活化酯凭借其高量子产率和优异的光稳定性，在诸多前沿研究中展现出独特价值。本文将从标记化学基础出发，结合最新文献证据，系统梳理该试剂的研究进展与应用前景。

2 光物理特性与标记化学基础

AF594 NHS活化酯的核心优势源于其分子结构设计。磺化罗丹明骨架赋予其良好的水溶性，减少了在生物体系中的非特异性聚集；而NHS酯基团则在温和的碱性条件（pH 7.2–8.5）下与伯胺高效反应，形成共价酰胺键。该反应具有较高的化学选择性，在常规标记条件下，可与N端氨基及赖氨酸侧链氨基发生反应，标记效率受pH、摩尔比及缓冲液组成等因素影响。值得注意的是，产品资料中提及的最大激发波长存在586 nm与594 nm两种表述，这通常源于不同溶剂环境或仪器校准差异，实验设计时应以实际光谱测定为准。

在标记方案优化方面，建议采用无水DMSO或DMF溶解AF594 NHS活化酯，避免水分导致的NHS酯水解。标记反应后，需通过凝胶过滤或透析去除游离染料，并对标记产物的 degree of labeling（DOL）进行表征。尽管AF594 NHS活化酯的光稳定性优于传统荧光素类染料，但在强激光激发下仍存在光漂白风险，尤其在超分辨成像中需权衡激发强度与信号持续性。

3 荧光标记与成像应用进展

AF594 NHS活化酯的应用场景涵盖免疫荧光、流式细胞术、蛋白质印迹及活体成像等多个层面。在免疫荧光中，该染料常与DAPI或Hoechst等核染料联用，实现多色成像；其红色发射信号与绿色荧光探针（如AF488）的光谱分离度良好，适用于共定位分析。在流式细胞术中，AF594的亮度和光稳定性使其成为多参数面板的优选染料之一。

在活体成像领域，AF594的发射波长虽处于红色窗口，但相较于近红外染料（如AF647或AF750），其组织穿透深度仍有限。近期一项研究[1]探索了68Ga放射性标记的荧光染料用于蛛网膜下腔出血的多模态成像，该研究使用了Alexa Fluor 594的氨基衍生物（Alexa Fluor 594 1,5-diaminopentane）与NODA-GA-NHS酯偶联，构建了荧光-放射性双功能探针。尽管该工作并非直接使用AF594 NHS活化酯，但其策略揭示了AF594衍生物在PET/荧光多模态成像中的可行性。需要指出的是，该研究主要聚焦于放射性标记效率与纯化，未系统报道AF594的光谱特性、标记效率或细胞毒性等关键荧光表征数据，因此其结论的普适性仍需进一步验证。对于AF594 NHS活化酯而言，直接用于活体成像时，需考虑染料与靶向分子的偶联比例对药代动力学的影响，以及肝脏和肾脏对染料的清除效应。

4 多模态成像与探针开发的前沿方向

多模态成像旨在整合不同成像技术的优势，实现解剖结构与功能信息的互补。AF594 NHS活化酯可作为荧光模块，与放射性核素（如68Ga、89Zr）或磁共振对比剂偶联，构建双模态或多模态探针。然而，此类探针的设计需兼顾不同模态的灵敏度与分辨率差异，并确保标记过程不破坏靶向分子的生物活性。文献[1]的尝试表明，通过NHS酯化学将荧光染料与螯合剂连接是可行的，但该研究采用的氨基衍生物路线与直接使用NHS活化酯的偶联策略存在差异，前者需预先引入氨基连接臂，后者则直接与生物分子氨基反应，操作更为简便。

未来，AF594 NHS活化酯在探针开发中的潜力可能体现在以下方面：其一，与纳米载体（如脂质体、聚合物胶束）结合，实现荧光示踪与药物递送的一体化；其二，用于构建荧光猝灭型探针，通过酶切或构象变化恢复荧光信号，提高检测特异性；其三，结合超分辨成像技术（如STORM、PALM），解析亚细胞结构动态。值得注意的是，上述应用方向目前尚缺乏针对AF594 NHS活化酯的系统性研究，多数证据来自其他AF系列染料或类似光谱探针，因此需谨慎外推。

5 局限性与标准化建议

尽管AF594 NHS活化酯具有诸多优点，但其应用仍存在局限。首先，NHS酯的水解敏感性要求标记过程在无水条件下进行，操作不当易导致标记效率下降。其次，AF594的发射波长位于红色区域，对于深层组织成像的穿透能力有限，不适用于大动物或人体深部组织成像。此外，目前缺乏针对该产品在复杂生物基质中的系统性稳定性数据，如血清半衰期、光漂白动力学等，这在一定程度上限制了其临床转化潜力。

为提高研究可重复性，建议在发表相关工作时，详细报告标记条件（缓冲液、pH、摩尔比、反应时间）、纯化方法及标记产物的表征数据（如DOL、荧光光谱、光稳定性曲线）。对于多模态探针研究，还应提供放射性标记效率、体内分布及药代动力学参数，以全面评估探针性能。

6 结语与展望

AF594 NHS活化酯作为红色荧光标记工具，在基础研究和转化医学中具有广泛的应用前景。从免疫荧光到多模态成像，该试剂为研究者提供了可靠的标记手段。然而，当前针对该产品的直接研究证据仍较有限，多数应用数据来自AF系列染料的共性特征或其他衍生物。未来，随着对荧光探针性能要求的不断提升，AF594 NHS活化酯的标记化学优化、稳定性增强及多功能集成将成为研究热点。同时，标准化表征体系的建立将有助于推动该试剂在精准医学和活体诊断中的规范化应用。

参考文献

• 68Ga-radiolabeled fluorescent dye for potential non-invasive multimodal imaging of subarachnoid hemorrhage.

Jona Wilhelm Gerhards, Laura Schäfer, Daniel Kang, Ute Lindauer, Susanne Lütje, Felix Manuel Mottaghy, Tobias Schmidt, Andreas Theodor Josef Vogg · EJNMMI radiopharmacy and chemistry · 2025

DOI: 10.1186/s41181-025-00348-5

产品相关性评分: 56/100

关联性分析: 文献明确使用了Alexa Fluor™ 594染料，但并非直接使用目标产品AF594 NHS活化酯（CAS 295348-87-7），而是通过其氨基衍生物（Alexa Fluor 594 1,5-diaminopentane）与NODA-GA-NHS酯偶联，属于目标化合物的间接衍生物应用，因此化合物匹配度中等偏低。应用场景为荧光-放射性多模态成像（PET/荧光），涉及染料标记与活体示踪，与产品分类描述中的荧光标记应用有一定契合，但并非典型的细胞成像或免疫荧光场景。实验模型为大鼠蛛网膜下腔出血模型，与产品预期应用领域（如细胞标记、免疫荧光等）部分相关但匹配度一般。数据与方法方面，文献主要表征了放射性标记效率与纯化，未提供AF594的光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键荧光表征数据，严谨性不足。期刊影响力中等（EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry，H指数40，2年引用率4.17），研究具有一定创新性但非高影响力期刊。总体而言，文献使用了AF594的衍生物而非目标产品本身，应用场景相关但表征数据不足，综合评分56分。

• Global, regional, and national burden of meningitis, its risk factors, and aetiologies, 1990-2023: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2023.

The Lancet. Neurology · 2026

DOI: 10.1016/S1474-4422(26)00101-8

产品相关性评分: 16/100

关联性分析: 该文献为GBD 2023脑膜炎全球疾病负担系统分析，属于流行病学与公共卫生领域，完全不涉及荧光染料、AF594NHS活化酯或任何荧光标记/成像实验。文中未使用目标化合物或其衍生物，也无光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等表征内容，应用场景与产品分类描述无契合。仅因发表于The Lancet Neurology具有较高期刊影响力而给予少量影响力分数，整体与目标产品无相关性。

• Impact of cancer on outcomes following breakthrough ischaemic stroke on oral anticoagulants for atrial fibrillation: insights from the ASPERA-R study.

Matteo Foschi, Federico De Santis, Francesca Gabriele, Lucio D'Anna, Andrea Zini, Matteo Paolucci, Stefano Forlivesi, Ludovica Migliaccio, Maria Maddalena Viola, Angelo Cascio Rizzo, Maria Sessa, Ghil Schwarz, Rachele Tortorella, Soma Banerjee, Gaurav Desai, Muhammad Jaffar, Gabriele Prandin, Leonardo Pantoni, Francesco Mele, Giuseppe Scopelliti, Ilaria Cova, Mariarosaria Valente, Domenico Maisano, Luca Antonelli, Maria Rosaria Bagnato, Giovanni Di Mauro, Francesca Bernocchi, Martina Gaia Di Donna, Barbara Casolla, Myriam Perla Mazloum, Kristina Kacani, Noufel-Anis Djeghlal, Laura González-Martín, Ricardo Rigual, Blanca Fuentes, Carlos Hervás, Paolo Candelaresi, Vincenzo Andreone, Antonio De Mase, Emanuele Spina, Diana Aguiar de Sousa, Mariana Almudi Souza, Alberto Fior, Miguel Serôdio, Pietro Caliandro, Aurelia Zauli, Giuseppe Reale, Ahmed Abdelalim, Sandra Ahmed, Nourhan Mohamed Soliman, Liqun Zhang, Tara Latimer, Muhammad Elboghday, Ahmed Aly Elbassiouny, Tamer Roushdy, Hossam Shokri, Federica Ferrari, Nicola Davide Loizzo, Federico Mazzacane, Maria Guarino, Valentina Barone, Paola Forti, Giuseppe Rinaldi, Marco Vito Rossi, Vincenzo Laterza, Giovanni Frisullo, Pier Andrea Rizzo, Aldobrando Broccolini, Marina Mannino, Valeria Terruso, Marcella Caggiula, Annalisa Rizzo, Ana Catarina Fonseca, Bernardo Antunes, Ana M Barbosa, Hrvoje Budincevic, Petra Crnac, Giovanna Viticchi, Mauro Silvestrini, Lorenzo Barba, Markus Otto, Piergiorgio Lochner, Benjamin Landau, Sandeep Buddha, Roumeisa Khalil, Maria Grazia Piscaglia, Elena Minguzzi, Marialuisa Zedde, Ahmed Nasreldein, Luisa Vinciguerra, Luis Costa, Ahmed Elsaid Elsayed, Mona AlBanna, Laura Tudisco, Maria Giulia Mosconi, Giovanni Merlino, Alexandros Polymeris, Raffaele Ornello, Simona Sacco · European stroke journal · 2026

DOI: 10.1093/esj/aakag015

产品相关性评分: 12/100

关联性分析: 该文献是一项关于房颤患者口服抗凝期间突破性缺血性卒中后癌症对90天结局影响的多中心回顾性临床研究（ASPERA-R研究），完全不涉及荧光染料、AF594 NHS活化酯或任何荧光标记/成像技术。文中未使用目标化合物或其衍生物，也未涉及细胞成像、流式细胞术、免疫荧光、蛋白/核酸标记等任何相关应用场景；实验模型为人类卒中患者队列，与荧光探针的预期应用领域无关；未提供任何光谱、标记效率、细胞毒性或光稳定性等表征数据。仅期刊影响力维度得分较高（European Stroke Journal，h指数60），但与目标产品相关性极低，总分仅12分。

• An Evaluation of Oral Anticoagulant Safety Indicators by England's Community Pharmacies.

Sejal Parekh, Lingqian Xu, Carina Livingstone · Pharmacy (Basel, Switzerland) · 2024

DOI: 10.3390/pharmacy12050134

产品相关性评分: 7/100

关联性分析: 该文献主题为英国社区药房口服抗凝药安全指标评估，属于药学服务与药物警戒领域，完全不涉及荧光染料、AF594NHS活化酯或任何荧光标记/成像实验。文中出现的'AF'为心房颤动（atrial fibrillation）缩写，与AlexaFluor系列染料无关，也未使用目标化合物或其衍生物。无光谱数据、标记效率或细胞/动物模型等荧光相关表征，应用场景与产品分类描述毫无契合。仅因期刊为一般药学类期刊给予极低影响力分数。

• Atrial fibrillation and risk of progressive heart failure in patients with preserved ejection fraction heart failure.

John Gierula, Charlotte A Cole, Michael Drozd, Judith E Lowry, Sam Straw, Thomas A Slater, Maria F Paton, Rowenna J Byrom, Ellis Garland, Georgia Halliday, Sarah Winsor, Gemma K Lyall, Karen Birch, Melanie McGinlay, Emma Sunley, Peter J Grant, David H Wessels, Elias M Ketiar, Klaus K Witte, Richard M Cubbon, Mark T Kearney · ESC heart failure · 2022

DOI: 10.1002/ehf2.14004

产品相关性评分: 9/100

关联性分析: 该文献为心力衰竭与房颤的临床队列研究，完全不涉及荧光染料、AF594NHS活化酯或任何荧光标记/成像技术。文献未使用目标化合物，也未涉及任何荧光应用场景、细胞或动物模型及光谱/标记表征数据，因此前四项均给最低分。仅因发表于ESC Heart Failure（期刊影响力尚可）给予少量影响力分数，但与目标产品无实质相关性。

• Cemented or Uncemented Hemiarthroplasty for Intracapsular Hip Fracture.

Miguel A Fernandez, Juul Achten, Nicholas Parsons, Xavier L Griffin, May-Ee Png, Jenny Gould, Alwin McGibbon, Matthew L Costa · The New England journal of medicine · 2022

DOI: 10.1056/NEJMoa2108337

产品相关性评分: 7/100

关联性分析: 该文献是一项关于髋部骨折半髋关节置换术（骨水泥型与非骨水泥型）的临床随机对照试验，发表于NEJM，完全不涉及荧光染料、AF594NHS活化酯或任何荧光标记/成像应用。文中未使用目标化合物或其衍生物，也未涉及细胞、分子标记或光谱表征等任何相关实验体系，因此化合物匹配度、应用场景相关性、模型匹配度和方法学严谨性均极低。仅因期刊影响力较高而给予少量影响力分数。