1 引言

近红外（NIR）荧光成像凭借组织自发荧光低、光散射小和穿透深度较深等优势，已成为化学生物学与活体成像的重要工具。花菁类染料Cy5及其磺化衍生物因摩尔吸光系数高、荧光量子产率适中而应用广泛。然而，传统铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）存在铜离子细胞毒性问题，限制了其在活细胞和活体体系中的应用。应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）利用环张力驱动的二苯并环辛炔（DBCO）与叠氮基团在无铜条件下快速反应，为生物正交标记提供了温和高效的替代方案。Cy5-DBCO（DBCO-Sulfo-Cy5）正是将磺化Cy5荧光团与DBCO基团共价连接的双功能探针，吸收和发射波长分别为646 nm和670 nm，处于近红外窗口边缘，适用于组织穿透要求较高的成像场景。产品说明明确指出该染料不适合对通透性细胞的胞内成分进行染色，且可能表现出较高背景，这与其磺化结构导致的膜通透性降低密切相关，也决定了其应用主要集中于细胞表面、细胞外基质及活体水平的标记与示踪。本文围绕SPAAC反应在荧光探针构建中的研究背景与最新进展，结合近期文献中Cy5-DBCO的具体使用案例，分析其应用模式、方法学优势与现有局限。

2 SPAAC反应与Cy5-DBCO的化学基础

SPAAC反应的核心在于DBCO中环辛炔的环张力降低了炔烃活化能，使其无需铜催化剂即可与叠氮基团发生[3+2]环加成，生成稳定的三唑连接。该反应在生理条件下动力学速率较快，对水、氧不敏感，官能团耐受性好，特别适合复杂生物环境中的选择性标记。Cy5-DBCO将DBCO的反应活性与Cy5的荧光报告功能整合于同一分子，使用时只需与叠氮修饰的靶标混合即可一步完成荧光标记。磺化修饰赋予Cy5较好的水溶性，降低了非特异性疏水吸附，但同时增加了分子极性，使其难以被动扩散穿过完整细胞膜。这一结构-性质关系解释了产品说明中“不适合通透性细胞胞内成分染色”的提示，也提示实验设计应优先考虑膜表面或细胞外靶标。值得注意的是，尽管Cy5-DBCO已在多项研究中作为标记试剂使用，但针对该化合物本身的光谱表征、光稳定性、反应动力学及细胞毒性等基础数据仍较缺乏，现有文献多将其作为工具试剂一笔带过，限制了不同研究结果的可比性。

3 细胞表面与组织水平的生物正交标记

在细胞与组织层面，SPAAC反应的一个重要应用是对代谢糖工程引入的叠氮基团进行荧光检测。近期一项研究将代谢糖工程与生物正交反应结合，利用DBCO-Cy5（即Cy5-DBCO）检测角膜上皮细胞表面的叠氮基团，以评估透明质酸在眼表的滞留增强效果[4]。该研究在人角膜上皮细胞和小鼠干眼模型中观察到，经生物正交反应后Cy5荧光信号增强十倍以上，表明DBCO-Cy5能有效标记细胞表面的人工叠氮受体。这一应用模式与Cy5-DBCO的膜不通透特性高度契合：代谢糖工程将叠氮糖类似物整合至细胞表面糖链，DBCO-Cy5无需进入细胞即可与膜外叠氮基团反应，实现选择性表面标记。但该研究中Cy5-DBCO主要作为检测工具而非研究对象，文献未提供其光谱数据、标记效率或细胞毒性等关键表征，方法学严谨性有待加强[4]。

除细胞表面标记外，SPAAC反应也被用于生物材料表面功能化。一项针对丝素蛋白电纺垫的研究利用DBCO点击化学将叠氮标记的货物共价固定于材料表面，并以Az-Cy5染料验证偶联成功[3]。需要指出，该研究中Cy5与DBCO是分开使用的：DBCO固定在材料上，Cy5通过叠氮反应间接标记，而非直接使用Cy5-DBCO偶联物。该工作从侧面证明了DBCO-叠氮点击化学在材料表面标记中的可行性，但其实验模型为材料表面而非细胞或动物，与Cy5-DBCO的典型生物应用场景存在距离，相关性有限[3]。

4 纳米载体与外泌体工程化中的荧光示踪

纳米药物递送系统的体内命运追踪高度依赖荧光标记。一项研究通过正交共价捕获策略将荧光染料包载于可生物降解聚合物胶束中，其中使用Sulfo-Cy5作为模型染料，并借助DBCO与叠氮修饰的胶束发生点击反应[2]。虽然该研究并未直接使用Cy5-DBCO偶联物，但其设计思路——利用DBCO-叠氮反应实现染料与载体的共价连接——与Cy5-DBCO的应用逻辑一致。该工作在PC3细胞中评估了胶束的细胞毒性和摄取行为，但缺乏对染料光谱性质、标记效率或光稳定性的表征[2]，再次反映出荧光染料常作为“配角”出现，其自身理化性质对成像质量的影响未得到充分重视。

更具代表性的案例来自外泌体工程化领域。一项预印本研究利用无铜点击化学对脑源性外泌体进行线粒体靶向修饰，并将Cy5-DBCO作为线粒体靶向配体的荧光标记示例[1]。该研究涉及神经元培养、SD大鼠和高血压DSS大鼠模型，应用场景涵盖外泌体标记、线粒体共定位成像及体内生物分布分析。Cy5-DBCO的近红外荧光特性使其适用于活体成像中的外泌体示踪，而SPAAC的无铜特性则避免了对exosome膜结构和生物活性的潜在损伤。然而，该文献为预印本，尚未经过同行评议，且Cy5-DBCO可能仅作为示例配体使用，未对该染料本身进行充分表征，其结论的稳健性需谨慎看待[1]。

5 亚细胞结构探针合成中的模块化应用

SPAAC反应的另一类应用是模块化组装亚细胞靶向探针。一项研究通过SPAAC反应将Cy5-DBCO与叠氮修饰的Hoechst染料偶联，制备Hoe-Cy5偶联物，用于细胞核与线粒体成像[6]。在该工作中，Cy5-DBCO作为反应原料之一，与叠氮-Hoechst在溶液中反应生成双功能探针，随后用于活细胞成像。文献观察到该偶联物在活细胞中可积累于线粒体，这与Cy5-DBCO产品说明中“不适合通透性细胞胞内成分染色”的提示存在一定偏差。可能的解释是，Hoechst模块赋予了偶联物一定的膜渗透性或主动富集能力，从而改变了Cy5-DBCO本身的分布行为。这一案例说明，Cy5-DBCO的膜通透性限制并非绝对，通过合理的分子设计可部分克服，但也提示在研究中对染料分布进行逐例验证的必要性。该文献未提供Cy5-DBCO本身的光谱数据或细胞毒性信息，方法学严谨性一般[6]。

此外，一项关于氟化聚plex递送siRNA的研究将DBCO作为聚合物侧链官能团用于无铜点击交联，并仅使用Cy5-siRNA作为示踪剂，未使用Cy5-DBCO[5]。该研究与目标产品关联度较低，但其所代表的思路——将DBCO整合于递送载体而非游离染料——从反面凸显了Cy5-DBCO作为“即用型”荧光标记试剂的便利性：研究者无需对载体进行预先DBCO修饰，只需将叠氮标记的靶标与Cy5-DBCO混合即可完成标记。

6 现有局限与未来方向

综合上述文献，Cy5-DBCO在生物正交标记中的应用已覆盖细胞表面、组织、纳米载体和亚细胞探针等多个层面，但仍存在若干值得关注的问题。首先，产品说明明确指出该染料不适合通透性细胞的胞内成分染色，且可能表现出较高背景，这与磺化Cy5的膜不通透性和水溶性增强带来的非特异性相互作用有关。在复杂生物样本中，如何通过洗涤条件、封闭策略或探针结构优化降低背景，是实际应用中需要解决的问题。其次，现有文献多将Cy5-DBCO作为工具试剂使用，缺乏对该化合物光谱性质、光稳定性、反应动力学和细胞毒性的系统表征[1,4,6]，这种“重应用、轻表征”的倾向不利于实验结果的标准化和跨研究比较。第三，SPAAC反应虽无需铜催化剂，但DBCO基团在长时间光照或某些氧化条件下可能发生降解，进而影响标记稳定性，目前少有研究对此进行定量评估。

未来研究可从以下方向推进：其一，建立Cy5-DBCO在不同缓冲体系、pH和温度条件下的反应动力学与稳定性数据库，为实验设计提供依据；其二，开发针对磺化花菁染料非特异性吸附的封闭与洗涤方案，降低背景信号；其三，将Cy5-DBCO与新型叠氮标记策略（如代谢糖工程、非天然氨基酸引入）结合，拓展其在活体动态追踪中的应用；其四，在纳米药物和细胞治疗产品的质量控制中，探索Cy5-DBCO作为标准化荧光标签的可行性，推动标记流程的规范化。

7 结语

Cy5-DBCO作为无铜点击化学与近红外荧光成像交叉的典型试剂，其核心优势在于SPAAC反应的高选择性与近红外荧光的组织穿透能力。近期文献表明，该试剂已在细胞表面标记、组织滞留评估、外泌体工程化和亚细胞探针合成等场景中展现出实用价值，但其膜通透性限制和背景信号问题也划定了应用边界。当前证据多来自应用性研究，对染料本身的方法学表征尚不充分。未来需要在探针工程化、标准化评价和新型生物正交反应开发等方面持续投入，以充分发挥该类试剂在化学生物学与活体成像中的潜力。

参考文献

• Copper-Free Click Chemistry Enables High-Fidelity Engineering of Mitochondria-Targeted Brain-Derived Exosomes.

Xin Yan, Xinqian Chen, Shanshan Hou, Xiaoxu Li, Jingyue Ju, Zhiying Shan, Lanrong Bi · bioRxiv : the preprint server for biology · 2025

DOI: 10.1101/2025.11.19.689327

产品相关性评分: 72/100

关联性分析: 文献明确将Cy5-DBCO作为线粒体靶向配体（示例）用于无铜点击化学修饰脑源性外泌体，属于直接使用目标化合物。应用场景为外泌体标记、线粒体共定位成像及体内生物分布，与Cy5-DBCO的近红外荧光成像用途高度契合，但未涉及流式或超分辨等场景。实验模型包括神经元培养、SD大鼠和高血压DSS大鼠，与产品预期生物应用领域基本一致。方法学上提供了共定位效率、FRAP、体内分布等数据，但缺乏Cy5-DBCO本身的光谱表征、标记效率定量或细胞毒性数据，严谨性中等。期刊为bioRxiv预印本，影响力有限，创新性中等。总体相关性较高，但需注意文献中Cy5-DBCO可能仅作为示例配体，且未充分表征该染料本身。

• Orthogonal Covalent Entrapment of Cargo into Biodegradable Polymeric Micelles via Native Chemical Ligation.

Erik R Hebels, Felix Bindt, Johanna Walther, Michiel van Geijn, Jimmy Weterings, Qizhi Hu, Claudio Colombo, Rob Liskamp, Cristianne Rijcken, Wim E Hennink, Tina Vermonden · Biomacromolecules · 2023

DOI: 10.1021/acs.biomac.2c00865

产品相关性评分: 56/100

关联性分析: 文献主要研究通过NCL和点击化学将荧光染料共价包载于聚合物胶束中，明确使用了Sulfo.Cy5（Cy5的磺化衍生物）作为模型染料，但未明确使用目标产品Cy5-DBCO；文中DBCO仅作为点击化学试剂与叠氮修饰的胶束反应，而非Cy5-DBCO偶联物。应用场景为药物递送示踪和诊断成像，与荧光染料标记相关但非典型细胞成像或标记应用。实验模型为PC3细胞，与产品预期应用领域部分一致。方法学上提供了胶束尺寸和细胞毒性数据，但缺乏Cy5-DBCO的光谱、标记效率或光稳定性等关键表征。期刊Biomacromolecules影响力较好，但研究创新性中等，引用潜力一般。

• Amine-Reactive Augmentation of Silk Fibroin Mats for Increasing Cargo Retention Capabilities.

Kamali L Charles, Yunhui Xing, Ellen L Otto, Xi Ren, Phil G Campbell, David A Vorp, Justin S Weinbaum · Journal of functional biomaterials · 2026

DOI: 10.3390/jfb17040161

产品相关性评分: 31/100

关联性分析: 该文献主要研究通过DBCO点击化学将叠氮标记的货物固定到丝素蛋白电纺垫上，以增强伤口敷料中货物的保留能力。文中使用Az-Cy5染料（叠氮修饰的Cy5）来验证DBCO偶联成功，但并未使用目标产品Cy5-DBCO（即DBCO修饰的Cy5）。目标产品是Cy5荧光团直接连接DBCO基团，而文献中Cy5与DBCO是分开的：DBCO固定在材料上，Cy5通过叠氮反应间接标记。因此，化合物匹配度低（仅涉及Cy5和DBCO两种组分，但非目标化合物本身）。应用场景为生物材料表面标记和货物固定，与荧光染料在细胞成像、标记等典型应用相关性一般。实验模型为丝素蛋白电纺垫，非细胞或动物模型，与产品预期应用领域（细胞成像等）匹配度低。方法学上提供了荧光成像验证偶联成功，但缺乏目标化合物的光谱数据、标记效率等关键表征。期刊影响力中等。总体相关性较低。

• Enhanced corneal retention of hyaluronic acid via a metabolic glycoengineering-based in vivo bioorthogonal reaction.

Buwei Hu, Hui Wang, Chenlin Ji, Xuehan Xu, Luyi Wang, Tingting Cao, Menghua Gao, Yanjun Zhao, Bin Wang, Wenjing Xuan, Jianjun Cheng · Biomaterials science · 2026

DOI: 10.1039/d5bm01898f

产品相关性评分: 67/100

关联性分析: 文献明确使用DBCO-Cy5（即Cy5-DBCO，目标化合物），作为生物正交反应的荧光标记探针，用于检测角膜上皮细胞表面的叠氮基团，化合物匹配度高。应用场景为细胞和组织水平的荧光标记与成像，属于荧光探针在生物标记中的应用，但与产品分类描述的'不适合通透性细胞胞内成分染色'存在一定偏差，且未涉及流式、超分辨等典型场景，相关性中等。实验模型包括人角膜上皮细胞（HCECs）和小鼠干眼模型，与产品预期应用领域（细胞/组织标记）基本一致，模型匹配度较好。文献提供了Cy5保留量（荧光信号增强10倍以上）等数据，但未提供该化合物的光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键表征，方法严谨性一般。期刊Biomaterials Science影响力较好（H指数129），研究具有创新性（代谢糖工程+生物正交反应），引用潜力较高。总体而言，文献确实使用了目标化合物，但主要作为检测工具而非研究对象，应用场景与产品描述部分契合。

• "Zip-to-Cytosol": Glutathione-Cleavable Fluorinated Polyplexes Deliver siRNA at Single-Digit Nanomolar Dose with >90% Gene Silencing.

Yue Wang, Jingyi Wang, Hongyan Cui, Liuwei Zhang, Ruohan Zhao, Zhongwang Liu, Qian Zhong, Xin Wang, Yaojie Wang, Qixian Chen, Haining Yu, Yan Zhao · Bioconjugate chemistry · 2026

DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.5c00554

产品相关性评分: 37/100

关联性分析: 文献未使用目标化合物Cy5-DBCO，而是将DBCO作为聚合物侧链官能团用于无铜点击交联，并仅使用Cy5-siRNA作为示踪剂，因此化合物匹配度很低。应用场景为siRNA胞质递送与基因沉默，与Cy5-DBCO作为近红外荧光标记染料的典型用途（如活体成像、标记检测）相关性有限。实验模型为HeLa、HepG2和MDA-MB-468细胞，虽与荧光染料可能涉及的细胞成像体系有部分重叠，但并非产品预期应用领域。方法学上未提供Cy5-DBCO的光谱、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键表征数据。期刊Bioconjugate Chemistry影响力尚可，但研究创新点与目标产品无关。

• Hoechst modification by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition for transport of functional molecules into the cell nucleus.

Hiroki Makanai, Daisuke Mochizuki, Tatsuya Nishihara, Kazuhito Tanabe · Bioorganic & medicinal chemistry letters · 2024

DOI: 10.1016/j.bmcl.2024.129916

产品相关性评分: 34/100

关联性分析: 文献使用Cy5-DBCO（未明确是否为Sulfo-Cy5衍生物）与叠氮修饰的Hoechst通过SPAAC反应制备Hoe-Cy5偶联物，但目标产品Cy5-DBCO仅作为反应原料之一，并非研究核心；文献未提供Cy5-DBCO本身的光谱数据、标记效率或细胞毒性等表征，方法学严谨性不足。应用场景涉及细胞核/线粒体成像，与产品分类中'不适合通透性细胞胞内染色'的提示部分相关，但文献使用活细胞且观察到线粒体积累，与产品描述存在一定偏差。实验模型为活细胞成像，与荧光染料常规应用领域一致。期刊影响力中等，创新性一般。总体相关性较低。