1. 引言

近红外（NIR）荧光成像因其组织穿透深、背景自发荧光低及光毒性小等优势，已成为活细胞示踪、疾病诊断与药物递送监测的重要工具。在众多近红外荧光团中，花菁染料Cy5.5（激发/发射波长约675/695 nm）凭借其优异的光物理性质与良好的生物相容性，被广泛应用于生物分子标记与活体成像研究。然而，Cy5.5游离染料难以直接与生物大分子稳定结合，通常需借助活性酯衍生物实现共价偶联。Cy5.5 NHS ester（CAS: 910482-46-1）正是为此设计的氨基反应型荧光标记试剂，其NHS酯基团可在温和条件下与蛋白质、多肽、核酸及纳米颗粒表面的伯胺高效反应，形成稳定的酰胺键。近年来，随着核酸药物、靶向递送系统及高灵敏生物传感技术的快速发展，Cy5.5 NHS ester作为关键标记工具的研究价值日益凸显。本文结合近期文献，从化学偶联机制、生物分子标记策略及活体成像应用三个维度，综述Cy5.5 NHS ester的前沿进展，并讨论当前研究的局限与未来方向。

2. Cy5.5 NHS ester的化学特性与偶联机制

Cy5.5 NHS ester属于花菁染料家族，其核心结构为聚甲川链连接两个含氮杂环，赋予其近红外吸收与发射特性。NHS酯（N-羟基琥珀酰亚胺酯）基团具有较高的亲电性，在pH 7.0–8.5的缓冲体系中可与伯胺（如赖氨酸残基的ε-氨基或核酸5′端修饰的氨基）发生亲核取代反应，释放NHS并形成共价酰胺键。该反应条件温和、副产物水溶性好，适用于对有机溶剂敏感的蛋白质与核酸标记。值得注意的是，Cy5.5 NHS ester的水解稳定性相对有限，需在无水有机溶剂（如DMSO或DMF）中避光保存，并在标记反应中控制摩尔比与反应时间，以避免过度标记导致的荧光淬灭或生物分子活性丧失。尽管该试剂已商业化多年，但近期文献中关于其光谱表征、标记效率与光稳定性的系统数据仍较为缺乏，多数研究仅将其作为示踪工具，而未对染料本身的理化性能进行深入评估[1,2]。这一空白限制了不同研究间标记效率的可比性，也提示未来需建立标准化的标记与表征流程。

3. 核酸标记与示踪应用

核酸药物（如适配体、反义寡核苷酸与siRNA）的体内递送与生物分布监测高度依赖荧光标记。Cy5.5 NHS ester可通过与氨基修饰的寡核苷酸反应，实现核酸分子的近红外荧光标记。例如，在靶向黑色素瘤细胞MC1R受体的RNA适配体研究中，Cy5.5标记的适配体被用于流式细胞术检测，以评估其与细胞表面受体的结合特异性[1]。类似地，针对长链非编码RNA MALAT1的反义寡核苷酸（ASO）经Cy5.5标记后，成功用于肺癌与表皮癌细胞的近红外荧光成像，并实现了异种移植瘤模型的活体示踪[2]。这些研究证实了Cy5.5 NHS ester在核酸标记中的可行性，但需指出，上述文献并未明确使用Cy5.5 NHS ester本身，而是通过Cy5.5荧光团标记的核酸探针进行检测，因此关于该活性酯衍生物的直接标记效率与稳定性数据仍不充分。此外，在siRNA递送研究中，Cy5.5标记的siRNA被用于监测温敏水凝胶系统在卵巢癌模型中的滞留与分布[3]，以及脂质纳米颗粒包裹的巨噬细胞向肺部的迁移[4]。这些工作展示了Cy5.5 NHS ester在核酸药物递送研究中的潜在价值，但也暴露出标记过程可能影响核酸杂交动力学或基因沉默活性的风险，需在实验设计中设置未标记对照并优化标记度。

4. 蛋白质与肽载体的荧光修饰

除核酸外，Cy5.5 NHS ester亦广泛用于蛋白质与肽类载体的荧光标记。在肝细胞癌靶向基因递送研究中，研究者利用Cy5.5标记肽载体H-02与H-09，通过活体荧光成像评估其在肿瘤组织的富集与分布[6]。该应用依托NHS酯与肽链N端氨基或赖氨酸侧链氨基的偶联反应，实现了对载体药代动力学的实时追踪。然而，文献未提供标记效率、荧光强度与载体转染活性之间的定量关系，也未评估标记对肽载体靶向性的潜在影响。类似地，在基于量子点的DNA与蛋白酶多重检测生物传感器中，Cy5.5作为FRET级联的受体荧光团标记DNA，实现了对病原体核酸与蛋白酶活性的正交检测[5]。该研究突出了Cy5.5 NHS ester在构建多功能传感界面中的潜力，但同样未对染料本身的光稳定性与标记均一性进行系统表征。总体而言，蛋白质与肽类标记的应用较为广泛，但标记工艺的标准化与质量控制仍是制约其可重复性的关键因素。

5. 活体成像与流式细胞术中的前沿进展

Cy5.5 NHS ester标记的生物分子在活体成像与流式细胞术中的应用日益增多。近红外荧光成像借助Cy5.5的长波长发射，可有效降低组织自发荧光背景，提高信噪比。例如，Cy5.5标记的MALAT1 ASO在肺癌与表皮癌异种移植瘤模型中展现了良好的肿瘤对比度，并可通过离体器官分布验证其特异性[2]。在细胞追踪研究中，Cy5.5标记的siRNA-脂质纳米颗粒复合物被用于监测巨噬细胞从腹腔向肺部的迁移，为细胞治疗与炎症性疾病研究提供了可视化手段[4]。流式细胞术方面，Cy5.5标记的适配体被用于定量分析细胞表面受体表达水平[1]，其近红外荧光通道与常规流式细胞仪兼容，但需注意补偿设置与自发荧光干扰。尽管这些应用展示了Cy5.5 NHS ester的广阔前景，但现有文献多聚焦于生物学效应，而非染料本身的稳定性与毒性。例如，Cy5.5在长时间光照下可能发生光漂白，且高标记度可能引起生物分子构象变化或聚集，这些因素在活体成像定量分析中不容忽视。未来研究需结合光谱表征与细胞毒性实验，建立染料标记度与成像质量之间的优化关系。

6. 局限性与未来展望

综合近期文献，Cy5.5 NHS ester在生物偶联与活体成像中的应用已取得显著进展，但仍存在若干局限。首先，多数研究将Cy5.5 NHS ester作为间接标记工具，未对其光谱特性、水解稳定性、标记效率及细胞毒性进行系统表征，导致不同研究间数据可比性不足[1-6]。其次，标记反应的条件优化（如pH、摩尔比、反应时间）缺乏标准化方案，可能影响生物分子的活性与靶向性。第三，Cy5.5染料的光稳定性在长时间活体成像中的表现尚不明确，需开展光漂白动力学研究。未来方向包括：开发水溶性更好、稳定性更高的NHS酯衍生物；建立标准化的标记与纯化流程；结合多模态成像（如荧光-放射性双标记）提高定量准确性；以及探索Cy5.5 NHS ester在新型递送系统（如细胞外囊泡、工程化细菌）中的标记策略。随着核酸药物与精准医学的快速发展，Cy5.5 NHS ester作为近红外荧光标记的核心试剂，其标准化与功能化研究将为进一步提升活体成像的灵敏度与可靠性提供关键支撑。

7. 结论

Cy5.5 NHS ester凭借其近红外荧光特性与高效的氨基偶联反应，已成为核酸、蛋白质及肽类载体标记的重要工具。近期文献表明，该试剂在适配体示踪、反义寡核苷酸成像、siRNA递送监测及生物传感等领域展现出广泛的应用潜力。然而，当前研究对染料本身理化性能的表征仍显不足，标记工艺的标准化与光稳定性评估有待加强。未来通过系统化的标记化学研究与多模态成像技术的融合，Cy5.5 NHS ester有望在活体成像与靶向递送研究中发挥更重要的作用。

参考文献

• Structural characterization and molecular interaction studies of a novel RNA aptamer-MC1R macromolecular system using integrated computational and experimental approaches.

Howida M Nail, Ahmed G Soliman, Ivo Henrique Provensi Vieira, Khaled Metwally, Hui-Min David Wang · International journal of biological macromolecules · 2026

DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.152256

产品相关性评分: 16/100

关联性分析: 该文献使用Cy5.5标记的适配体（Cy5.5-labeled aptamer）进行流式细胞术检测，属于目标化合物Cy5.5 NHS ester的间接应用（通过NHS ester偶联标记），但文献并未明确研究或表征Cy5.5 NHS ester本身，也未提供该染料的光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键数据，因此化合物匹配度和方法学严谨性评分较低。应用场景（流式细胞术、细胞靶向检测）与Cy5.5系列典型应用部分契合；实验模型为黑色素瘤细胞系和HEK293T，与荧光标记的细胞成像/流式应用领域一致。期刊影响力较高，但研究重点在适配体结构表征而非染料性能，整体相关性中等。

• Fluorescence imaging of MALAT1 expression using a Cy5.5-labeled antisense oligonucleotide in lung cancer and epidermal carcinoma cells.

Zhenfeng Liu, Chengjun Yao, Haopeng Ni, Guolin Wang, Mengjie Dong · Cancer imaging : the official publication of the International Cancer Imaging Society · 2025

DOI: 10.1186/s40644-025-00903-y

产品相关性评分: 16/100

关联性分析: 该文献使用Cy5.5标记的反义寡核苷酸（Cy5.5-labeled MALAT1 ASO）进行近红外荧光成像，属于Cy5.5系列染料的直接应用场景，但并未明确使用目标产品Cy5.5 NHS ester（CAS 910482-46-1）；Cy5.5 NHS ester是用于标记氨基化寡核苷酸的活化酯衍生物，文献未说明ASO标记所用的具体Cy5.5试剂形式，因此化合物匹配度较低（2分）。应用场景涉及细胞荧光成像、流式细胞术及活体近红外成像，与Cy5.5系列产品的典型应用（核酸标记、细胞与活体成像）高度契合（4分）。实验模型包括A549、A431、PC9GR、PC9细胞系及相应异种移植瘤模型，与产品预期应用领域一致（4分）。文献提供了细胞内荧光强度、浓度依赖性、体内肿瘤对比度及离体器官分布等数据，但缺少该染料本身的光谱表征、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键数据（3分）。期刊为Cancer Imaging，属专业影像学期刊，研究具有一定应用价值但创新性中等（3分）。

• Injectable thermosensitive hydrogel for local and controlled delivery of siRNA-STAT3 polyplexes to treat advanced-stage ovarian cancer.

Cristina Casadidio, Marcel H A M Fens, Lies A L Fliervoet, Roberta Censi, Tina Vermonden · Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society · 2025

DOI: 10.1016/j.jconrel.2025.113890

产品相关性评分: 13/100

关联性分析: 该文献使用了siRNA-Cy5.5标记进行生物分布和滞留监测，但Cy5.5是作为siRNA的荧光标签，而非直接使用目标产品Cy5.5 NHS ester。文献未明确研究或使用Cy5.5 NHS ester本身，也未提供其光谱、标记效率、细胞毒性或光稳定性等表征数据。应用场景为活体成像/生物分布，与Cy5.5系列荧光染料的应用有一定关联，但并非产品分类描述的核心应用。实验模型为卵巢癌小鼠模型，与产品预期应用领域部分一致。期刊影响力较高，但化合物匹配度低，整体相关性有限。

• Lipid nanoparticle encapsulated large peritoneal macrophages migrate to the lungs via the systemic circulation in a model of clodronate-mediated lung-resident macrophage depletion.

Dhaval Oza, Fernando Ivich, Joshua Pace, Mikyung Yu, Mark Niedre, Mansoor Amiji · Theranostics · 2024

DOI: 10.7150/thno.91062

产品相关性评分: 14/100

关联性分析: 文献中使用的是siRNA偶联Cy5.5染料（siRNA-Cy5.5），而非目标产品Cy5.5 NHS ester。Cy5.5 NHS ester是用于标记氨基的活化酯，文献中未明确使用该试剂，仅使用了Cy5.5荧光团作为示踪标记，因此化合物匹配度较低。应用场景涉及活体成像、流式细胞术和免疫细胞追踪，与Cy5.5系列染料的生物标记应用有一定相关性。实验模型为小鼠腹腔巨噬细胞迁移至肺部，属于活体成像和细胞示踪领域，与产品预期应用领域部分一致。文献未提供Cy5.5 NHS ester的光谱数据、标记效率或细胞毒性等关键表征数据，方法学严谨性不足。期刊Theranostics影响力较高，研究具有创新性，但引用潜力未知。总体而言，文献与目标产品相关性较弱，未真正使用目标化合物。

• Multiplexed DNA and Protease Detection with Orthogonal Energy Transfer on a Single Quantum Dot Scaffolded Biosensor.

David A Hastman, Shelby Hooe, Matthew Chiriboga, Sebastián A Díaz, Kimihiro Susumu, Michael H Stewart, Christopher M Green, Niko Hildebrandt, Igor L Medintz · ACS sensors · 2024

DOI: 10.1021/acssensors.3c01812

产品相关性评分: 15/100

关联性分析: 文献中明确使用了Cy5.5染料标记DNA，但未指明为Cy5.5 NHS ester，也未涉及该活性酯衍生物的直接标记反应或表征；Cy5.5仅作为FRET级联中的受体荧光团。应用场景为基于量子点的DNA和蛋白酶多重检测生物传感器，属于传感检测领域，与产品分类描述有一定契合但非典型细胞成像或流式应用。实验模型为体外核酸杂交和蛋白酶切割体系，与Cy5.5 NHS ester常用于抗体/蛋白标记的预期应用领域不一致。数据方面提供了FRET表征和传感性能，但缺乏Cy5.5 NHS ester本身的光谱数据、标记效率或细胞毒性等关键表征。期刊ACS Sensors影响力较高，研究创新性较好。总体相关性中等偏低。

• Multifunctional gene delivery vectors containing different liver-targeting fragments for specifically transfecting hepatocellular carcinoma (HCC) cells.

Qin Cheng, Taoran Wang, Jing Zhang, Long Tian, Chunlan Zeng, Zhao Meng, Changhao Zhang, Qingbin Meng · Journal of materials chemistry. B · 2023

DOI: 10.1039/d3tb01866k

产品相关性评分: 16/100

关联性分析: 文献使用Cy5.5标记肽载体H-02和H-09（即H-17和H-18）进行活体荧光成像，明确涉及Cy5.5荧光染料，但未指明具体使用Cy5.5 NHS ester（CAS: 910482-46-1），可能通过NHS酯偶联制备，属于直接衍生物应用，但化合物匹配度中等。应用场景为活体荧光成像，与Cy5.5系列常用生物成像高度相关。实验模型为HCC细胞系和活体小鼠，与产品预期应用领域一致。然而，文献未提供Cy5.5的光谱数据、标记效率、细胞毒性或光稳定性等关键表征，方法学严谨性不足。期刊为Journal of Materials Chemistry B，影响力和创新性中等。