一、分子定义与化学特性
2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate，简称 DCFH-DA，CAS 号：4091-99-0），是一种人工合成的非荧光性脂溶性化合物，化学名称为 2-(2,7 - 二氯 - 3,6 - 二羟基 - 9H - 氧杂蒽 - 9 - 基) 乙酸二乙酸酯，分子式 C₂₄H₁₆Cl₂O₈，分子量 487.29。其分子结构核心由二氯二氢荧光素母核与两个乙酸酯基团构成，乙酸酯基团的存在赋予其良好的脂溶性和细胞渗透性，而二氯二氢荧光素母核则是其氧化后产生荧光的关键结构。

DCFH-DA 的光谱特性具有明显的氧化依赖性：未氧化状态下（DCFH-DA）无明显荧光发射；经细胞内酯酶水解并被活性氧（ROS）氧化后，生成 2',7'- 二氯二氢荧光素（DCF），在激发波长 488 nm、发射波长 525 nm 处呈现明亮的绿色荧光，摩尔消光系数达 59,000 M⁻¹cm⁻¹，荧光量子产率高，信号稳定，可通过荧光显微镜、流式细胞仪等常规设备精准检测，适配多种科研实验体系。

二、作用机制：酯酶激活与 ROS 特异性氧化的双重触发
DCFH-DA 作为活性氧族的特异性细胞渗透性指示剂，其检测机制依赖 “酯酶水解激活 + ROS 氧化发光” 的双重过程，区别于直接响应 ROS 的荧光探针，具有更高的细胞内特异性。

未进入细胞时，DCFH-DA 因乙酸酯基团的封闭作用处于非荧光状态，且脂溶性结构使其可自由穿透完整细胞膜，无需破坏细胞结构即可进入细胞内。进入细胞后，细胞内的非特异性酯酶会特异性水解其分子上的两个乙酸酯基团，去除封闭结构，生成水溶性的 2',7'- 二氯二氢荧光素（DCFH）；DCFH 本身仍无荧光，但具有强还原性，当细胞内存在 ROS（如超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基、次氯酸等）时，会被 ROS 特异性氧化，生成具有强荧光的 DCF。

值得注意的是，DCFH 仅对 ROS 敏感，对细胞内其他还原性物质（如谷胱甘肽）无明显响应，且氧化过程不可逆，荧光信号强度与细胞内 ROS 的浓度呈显著正相关，可通过荧光强度量化细胞内 ROS 的相对含量，实现对细胞内 ROS 水平的定性、定量及动态监测。与其他 ROS 探针相比，DCFH-DA 无细胞毒性（常规工作浓度下），细胞渗透性强，检测范围广，可响应多种类型 ROS，是目前 ROS 检测中应用最广泛的探针之一。

三、多领域科研应用
1. 细胞氧化应激与损伤机制研究
DCFH-DA 是氧化应激研究的核心工具，广泛应用于各类细胞受外界刺激后 ROS 生成的动态监测。在氧化应激模型（如 H₂O₂、紫外线、重金属离子诱导）中，可通过 DCFH-DA 染色检测细胞内 ROS 浓度变化，分析氧化应激与细胞损伤的关联。例如，在紫外线诱导的皮肤角质细胞损伤研究中，DCFH-DA 染色显示，紫外线照射后细胞内 DCF 荧光强度显著升高，且与照射时间呈剂量依赖性，结合细胞活力检测，可明确 ROS 过量生成是皮肤细胞损伤的关键机制；在重金属（如铅、镉）毒性研究中，通过 DCFH-DA 量化 ROS 水平，可揭示重金属诱导细胞凋亡的氧化应激通路，为重金属毒性机制解析提供实验依据。

2. 细胞凋亡与肿瘤药理学研究
ROS 过量积累是诱导细胞凋亡的重要途径，DCFH-DA 在肿瘤药理学研究中，可用于验证抗肿瘤药物的作用机制，筛选靶向 ROS 的抗肿瘤候选药物。在肿瘤细胞（如 HeLa、A549 细胞）凋亡模型中，通过 DCFH-DA 染色检测发现，抗肿瘤药物处理后，肿瘤细胞内 ROS 浓度显著升高，荧光强度较对照组提升 2-3 倍，且 ROS 升高先于细胞凋亡标志物（如 caspase-3 激活）出现，明确药物通过诱导 ROS 积累触发肿瘤细胞凋亡；同时，可通过 DCFH-DA 筛选具有抗氧化或促氧化活性的化合物，为肿瘤治疗药物研发提供精准参照。

3. 神经科学与神经退行性疾病研究
ROS 过量产生是阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的核心病理特征，DCFH-DA 为相关疾病机制研究提供了直观工具。在帕金森病细胞模型（MPP⁺诱导的 PC12 细胞）中，DCFH-DA 染色显示，MPP⁺处理后神经元内 ROS 浓度显著升高，荧光信号弥散，且 ROS 积累程度与神经元损伤、凋亡率呈正相关；当加入抗氧化剂干预后，ROS 浓度下降，神经元存活率提升，证实 ROS 过量是神经元损伤的关键因素，为神经保护药物的研发提供实验支撑；此外，其还可用于研究神经炎症中 ROS 的生成规律，解析炎症与神经损伤的关联。

4. 心血管疾病与代谢疾病研究
在心血管疾病研究中，DCFH-DA 可用于监测血管内皮细胞、心肌细胞内 ROS 水平，解析动脉粥样硬化、高血压等疾病的发病机制。例如，在动脉粥样硬化模型中，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）可诱导血管内皮细胞 ROS 过量生成，通过 DCFH-DA 量化 ROS 水平，可分析 ox-LDL 对内皮细胞损伤的影响，以及抗氧化药物的干预效果；在代谢疾病（如 2 型糖尿病）研究中，DCFH-DA 可检测胰岛 β 细胞、脂肪细胞内 ROS 浓度变化，揭示 ROS 在胰岛素抵抗、胰岛功能损伤中的调控作用，为代谢疾病的干预策略研发提供依据。

5. 药理学与药物毒性评估研究
DCFH-DA 可用于药物、化妆品等产品的氧化毒性评估，筛选具有潜在氧化损伤风险的成分，同时也可评估药物的抗氧化活性。在药物毒性评估中，通过 DCFH-DA 染色检测药物处理后细胞内 ROS 水平，若 ROS 浓度显著升高，提示药物可能具有氧化毒性，需进一步优化剂量或结构；在抗氧化药物筛选中，可通过 H₂O₂诱导细胞产生过量 ROS，再加入候选药物，通过 DCFH-DA 检测荧光强度变化，评估药物的 ROS 清除能力，筛选高效抗氧化药物；此外，其还可用于中药提取物、天然产物的抗氧化活性评估，契合天然产物研发的科研热点。

6. 环境科学与微生物研究
在环境科学领域，DCFH-DA 可用于检测环境污染物（如农药、重金属、持久性有机污染物）对生物细胞的氧化损伤，评估污染物的生态毒性。例如，检测污水中污染物对水生生物细胞（如鱼类肝细胞）的 ROS 诱导作用，为水体污染风险评估提供数据支撑；在微生物研究中，可用于监测细菌、真菌在应激条件（如高温、低温、抗生素处理）下 ROS 的生成变化，解析微生物的应激适应机制，以及抗菌药物的作用机制。

DCFH-DA（CAS 4091-99-0）作为活性氧族检测领域的经典细胞渗透性荧光探针，以其 “酯酶水解激活、ROS 特异性氧化发光” 的独特机制，兼具细胞渗透性强、荧光信号稳定、操作便捷、低细胞毒性等优势，成为科研领域监测细胞内 ROS 水平的核心工具。